李星军，张瑜芬，李 锋△，朱小华，黄 岚
(1.上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科，上海 202150； 2.复旦大学附属华山医院皮肤科，上海 200040)
·论 着·
负向免疫调节分子TIPE2调控巨噬细胞亚型治疗狼疮小鼠的研究
李星军1，张瑜芬2，李 锋2△，朱小华2，黄 岚2
(1.上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院检验科，上海 202150； 2.复旦大学附属华山医院皮肤科，上海 200040)
目的 探讨肿瘤坏死因子诱导蛋白8样因子-2(TIPE2)调控系统性红斑狼疮(SLE)巨噬细胞极化的作用和对实验狼疮小鼠的治疗作用。方法 将小鼠分别用活化淋巴细胞来源的DNA(ALD-DNA)诱导狼疮小鼠模型，分为AAV-scr组和AAV-TIPE2组，从小鼠尾静脉注射AAV-TIPE2或AAV-scr病毒溶液。检测极化的巨噬细胞TIPE2 mRNA和蛋白表达、小鼠血清抗dsDNA抗体滴度、尿蛋白及肾病理指数。结果 (1)转染AAV-TIPE2细胞的TIPE2 mRNA和蛋白表达水平分别是AAV-scr组的(13.5±1.6)倍和(10.8±1.6)倍；(2)AAV-TIPE2组M2巨噬细胞特异分子MGL+为59.6%，AAV-scr组MGL+细胞为8.4%；AAV-TIPE2与AAV-scr转染的巨噬细胞M2/M1比值之比为16；(3)重组TIPE2基因的腺病毒相关载体在转染HEK-293中稳定表达，小鼠体内外实验证实AAV-TIPE2能诱导ALD-DNA狼疮小鼠巨噬细胞向M2极化；(4)AAV-TIPE2组血清抗dsDNA抗体、尿蛋白及肾病理等活动指标明显低于AAV-scr组(P<0.01)。结论 TIPE2诱导巨噬细胞极化为M2表型，缓解ALD-DNA诱导狼疮小鼠的病情，可以作为ALD-DNA诱导狼疮小鼠的一种有前景的治疗方法。
巨噬细胞；系统性红斑狼疮；腺病毒科；活化淋巴细胞来源的DNA；肿瘤坏死因子诱导蛋白8样蛋白-2
系统性红斑狼疮(SLE)是最为典型，并且迄今为止仍然是难治的慢性自身免疫性疾病，其病因和发病机制尚未明了，治疗仍然以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，其严重的不良反应威胁着SLE患者的生命健康。基因、性激素、感染和免疫功能异常一直是SLE病因学研究的几个重要方面。免疫功能异常是影响SLE发生、发展的重要因素之一。巨噬细胞极化是近几年免疫学研究热点，笔者前期研究结果显示，骨髓来源的单核细胞体外诱导分化M2，M2回输活化淋巴细胞来源的DNA(ALD-DNA)狼疮模型，可以减轻狼疮小鼠病情活动指标、降低dsDNA抗体滴度、改善肾病理指标[1]。肿瘤坏死因子诱导蛋白8样因子-2(TIPE2)是一种新发现的负性免疫调节蛋白，它调控Toll样受体(TLR)的信号转导，在固有免疫反应和适应性免疫反应中均发挥负性调节作用，这种作用可能与TIPE2调控巨噬细胞极化有关[2]。笔者构建AAV-TIPE2载体，通过体外和体内实验，探讨TIPE2促进SLE小鼠巨噬细胞极化及治疗SLE小鼠，为进一步细胞生物学治疗SLE打下基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物 SPF级10周龄BALB/c雌性小鼠，复旦大学实验动物科学部，许可证号：SYXK(沪)2014-0029。
1.2 方法
1.2.1 ALD-DNA制备 ConA活化或未活化小鼠脾细胞，S1核酸酶及蛋白酶K处理后，UltraPureTMgenomic DNA 纯化试剂盒(Shanghai SBS Genetech,China)，按说明步骤提取ALD-DNA，DNA的A260/A280比值>1.8，260 nm分光光度计测定DNA浓度。
1.2.2 动物免疫 10只BALB/c小鼠分为AAV-TIPE2组和AAV-scr组(各5只)。分别给两组小鼠皮下注射0.2 mL含ALD-DNA的磷酸盐缓冲液(PBS)诱导狼疮小鼠[1]。从两组小鼠尾静脉分别注射AAV-TIPE2或AAV-scr病毒溶液，每只小鼠注射AAV病毒数量为108PFU。免疫前和免疫后1、2、3和4周，分别取小鼠内眦静脉血和尿液。分离血清做dsDNA抗体和尿蛋白检测。4周后，取小鼠肾做病理切片并消化分离巨噬细胞。
1.2.3 狼疮性肾炎严重程度的评估 小鼠肾小球病理变化由有经验的病理医师盲法评价，每只小鼠评估100个肾小球，6个等级6分。正常无病变评分0分；Ⅰ级：小范围肾小球轻度肿胀，1分；Ⅱ级：小范围肾小球中度肿胀，2分；Ⅲ级：中度肿胀，但受累滤管区小于或等于50%，3分；Ⅳ级：中度肿胀，但受累滤管区大于50%，4分；Ⅴ级：重度肿胀，多数肾单位均受累，外皮层也受累，5分；Ⅵ级：重度肿胀，多数肾单位受累，有疤痕形成，6分。
1.2.4 尿蛋白的测定 考马斯亮蓝法检测[3]。
1.2.5 血清ssDNA、dsDNA滴度检测 ELISA方法检测[3]。
1.2.6 骨髓来源的单核巨噬细胞(BMDM)分离、培养和诱导分化 10周龄雌性小鼠，取BMDM，与FITC-F4/80抗体孵育，FCM分选阳性细胞，在DEME/F12培养，加入10 mmol/mL L-谷氨酰胺,100 U/mL青霉素,100 μg/mL链霉素和100 U/mL重组巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，体外分化实验如文献[1，4]所述。
1.2.7 流式细胞仪(FACS)分选不同亚型巨噬细胞 贴壁培养的BMDM，用0.25% Trypsine solution分离，PBS清洗3次、重新悬浮，用异硫氰酸荧光素(FITC)-F4/80抗体和APC-MGL抗体,分选巨噬细胞、M1和M2亚型。数据通过Flowjo Software分析、定量[4]。
1.2.8 细胞培养和目标基因的转染 人HEK293细胞(ATCC,Rockville,MD,USA)和小鼠巨噬细胞用DMEM培养基(DMEM,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，加15%胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)在5%CO2，37 ℃培养箱培养。HEK293和BMDA转导AAV(血清型8)-pCMV-PITE2和AAV-pCMV-scr[5-6]。步骤为：选取基因文库人TIPE2 cDNA(编号NM_001014039.1),前端和尾端分别加入EcoRⅠ和NheⅠ限制性酶切位点。亚克隆到带有50-EcoRⅠ位点和尾端30-NheⅠ位点的pAAV-CMV-GFP质粒载体(Clontech,Mountain View,CA,USA)，在TIPE2/scr和GFP基因之间构建2A多肽-ORF-多个顺向表达基因载体，2A多肽有利于高效、功能区蛋白组装完成。3个质粒共同转染：包括pAAV-pCMV-TIPE2-GFP或对照pAAV-pCMV-scr-GFP质粒(Clontech,Mountain View,CA,USA),R2C8(包括AAV2 Rep和AAV8 cap基因)和plAd5(包括腺病毒辅助基因)(Applied Viromics,LLC.Fremont,CA,USA)通过Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)转染到HEK293细胞，组装合成带有目标基因的AAV。病毒纯化采用CsCl密度离心，滴度采用定量光密度斑点实验定量。HEK293及原代小鼠巨噬细胞加入AAV(MOI为100)培养12 h。
1.2.9 实时定量PCR 巨噬细胞分选后，抽提RNA,合成cDNA，取1∶4稀释的cDNA，进行实时定量PCR(Quantitect SyBr green PCR system，Qiagen)。引物为:TIPE2正向5′-GAC TGA CCA CAT ACC CCA CTC-3′，反向 5′-TCA CCA AAG CTA AGT GCC GT-3′；CD163正向5′-TCC ACA CGT CCA GAA CAG TC-3′，反向5′-CCT TGG AAA CAG AGA CAG GC-3′；CD206正向5′-CAG GTG TGG GCT CAG GTA GT-3′，反向5′-TGT GGT GAG CTG AAA GGT GA-3′；iNOS正向5′-CAG AGG ACC CAG AGA CAA GC-3′，反向5′-TGC TGA AAC ATT TCC TGT GC-3′；Arginase正向5′-GCT GTC TTC CCA AGA GTT GGG-3′，反向5′-ATG GAA GAG ACC TTC AGC TAC-3′；α-tubulin正向5′-CCA AGC TGG AGT TCT CTA-3′，反向5′-CAG AGT GCT CCA GG-3′。数据收集和分析采用2-△△Ct方法，定量mRNA 相对表达水平，先与α-tubulin 比值，再与对照比较。
2 结 果
2.1 转染重组病毒细胞中TIPE2的过表达 制备AAV-TIPE2目标基因在CMV启动子控制下，空白对照带有无功能序列，两个病毒都带有GFP报告基因。病毒先感染HEK293细胞，通过FCM检测GFP荧光，分离和纯化转导细胞。目标基因和对照基因AAV病毒颗粒转染HEK293细胞,均能够表达强GFP荧光(图1A、B)。采用实时定量PCR和蛋白印迹检测转导细胞TIPE2的mRNA和蛋白表达水平，结果显示其表达水平为AAV-scr对照的(13.5±1.6)倍和(10.8±1.6)倍(图1C、D)。
A：FCM检测细胞GFP荧光强度，并纯化细胞；B：AAV-scr-和AAV-TIPE2组受感染细胞表达GFP强荧光；C：AAV-scr-和AAV-TIPE2-受感染细胞mRNA的表达；D:AAV-scr-和AAV-TIPE2-受感染细胞蛋白质的表达
图1 TIPE2- AAV过度表达载体的制备
2.2 TIPE2对体外培养的巨噬细胞极化的影响 用FCM分选狼疮小鼠BMDM,获得F4/80+细胞(图2)，结果显示，AAV-TIPE2组MGL+细胞为59.6%，MGL+/MGL-比值为1.44；而AAV-scr组MGL+细胞为8.4%，MGL+/MGL-比值为0.09。AAV-TIPE2组与AAV-scr组巨噬细胞M2/M1比值之比为16(图2D)。RT显示，M2表达CD163、CD206和Arginase等分子，M1表达iNOS分子(图2E)。
2.3 AAV-TIPE2对狼疮小鼠M2表达TIPE2 的影响 AAV-TIPE2处理小鼠F4/80双阳性巨噬细胞TIPE2的mRNA和蛋白表达水平显着高于AAV-scr处理组(8倍，图3)。
2.4 AAV-TIPE2在狼疮小鼠体内促进巨噬细胞向M2极化 AAV-TIPE2处理狼疮小鼠模型MGL+/F4/80+比值(40±10)明显高于AAV-scr组的(8±2)，差异有统计学意义(P<0.05)。狼疮小鼠模型体内实验也证实TIPE2可以诱导巨噬细胞向M2亚型极化。
2.5 AAV-TIPE2减轻狼疮小鼠模型狼疮病情活动指标 检测狼疮小鼠血清抗dsDNA抗体、尿蛋白及肾病理活动指标，结果显示AAV-TIPE2组血清抗dsDNA抗体、尿蛋白及肾病理活动指标明显低于AAV-scr组(表1)。
A：FCM分离的F4/80+巨噬细胞；B：培养纯化的巨噬细胞；C：FCM检测转染AAV-TIPE2或AAV-scr的M2巨噬细胞特异性表达MGL分子；D：C图的统计结果；E：实时定量PCR检测M2表达分子CD163、CD206、Arginase和M1表达分子iNOS；a：P<0.05,n=5。
图2 体外实验证实TIPE2诱导巨噬细胞极化
A：实验计划图；B：AAV-TIPE2-或AAV-scr-转染F4/80+巨噬细胞的GFP荧光强度；C：ALD-DNA+AAV-scr- 和 ALD-DNA+AAV-TIPE2-转染细胞TIPE2 mRNA表达水平；D：ALD-DNA+AAV-scr- 和 ALD-DNA+AAV-TIPE2-转染细胞TIPE2 蛋白质表达水平；a:AAV-TIPE2组与 AAV-scr 组比较P<0.05，n=10
图3 AAV-TIPE2对狼疮小鼠M2表达TIPE2的影响
3 讨 论
巨噬细胞是机体的重要免疫细胞，具有吞噬、抗原递呈和分泌多种细胞因子等功能，在病原微生物与衰老细胞的清除、促进炎性反应、适应性免疫反应的诱发及损伤组织重构与修复过程中起关键作用。近年来，其在SLE等自身免疫性疾病的免疫调节方面的作用也受到了极大的关注。巨噬细胞大体可分为两种类型，即M1和M2型。M1表达iNOS表型特征分子，并能够高效递呈抗原、高水平合成促炎细胞因子，是激活Th1细胞反应的效应细胞，具有抗病原微生物和肿瘤细胞的作用；M2巨噬细胞以CD163+、CD206+和Arginase+为其表型特征，抗原递呈功能弱，特征为低表达白细胞介素(IL)-12、高表达IL-10，具有抑制Th1免疫反应，具有调节免疫反应的作用。
笔者前期采用ALD-DNA诱导狼疮样小鼠。取骨髓来源的单核细胞，FACS分选F4/80+细胞，加入干扰素-γ(IFN-γ)或IL-4体外培养，通过特异性分子表达(M2特异性分子CD163、CD206、Arginase和M1特异性分子iNOS)筛选M1、M2。FACS和实时定量PCR检测CD163、CD206、Arginase和iNOS表达[1，4]。纯化的M2进行移植治疗狼疮小鼠结果显示：(1)氯磷酸盐清除巨噬细胞后，狼疮模型小鼠病情加重，给M2治疗后狼疮活动指数和肾病理改变明显改善。而单独注射M1则不能改善狼疮小鼠病情。(2)M2直接注射治疗可减轻狼疮模型小鼠病情。(3)M1过继移植可以加重狼疮模型小鼠病情活动指标[1]。
TIPE2可能是一种很强的M1/M2极化调节分子[7]，最新研究显示TIPE2可抑制iNOS表达，阻止NO和氧自由基(ROS)产生，而抑制炎性反应。但它在SLE中的调节作用目前尚少见报道。带着这个问题，应用已建立的ALD-DNA诱导的狼疮小鼠模型，研究TIPE2对SLE巨噬细胞极化的影响，并进一步探讨其治疗作用及机制。为了验证TIPE2促狼疮小鼠M/M1向M2极化，设计了AAV-TIPE2-GFP病毒载体，通过体外和体内实验，结果显示TIPE2基因的腺病毒相关载体在转染HEK293中稳定表达。在体外，TIPE2对体外培养的巨噬细胞，促进其M2分子CD163、CD206、Arginase表达，AAV-TIPE2处理小鼠GFP+P4/80+双阳性巨噬细胞TIPE2的mRNA和蛋白表达水平显着高于AAV-scr组。狼疮小鼠模型体内实验证实M2巨噬细胞高表达TIPE2分子，同时也证实小鼠肾的巨噬细胞极化为表达MGL的M2亚型。AAV-TIPE2能诱导ALD-DNA狼疮小鼠巨噬细胞向M2极化,并且改善狼疮小鼠病情活动指标。本研究表明，TIPE2可以减轻ALD-DNA诱导的狼疮小鼠的狼疮活动指数，缓解狼疮病情。
Li等[8]对39例SLE患者外周血单个核细胞TIPE2基因的表达进行了检测，SLE患者外周血单个核细胞TIPE2表达较正常对照组显着下调，且活动期比静止期下调更明显。同时，TIPE2的表达与SLE病情活动性指标SLEDAI之间存在高度的负相关，该结果表明TIPE2在SLE患者病情发展过程中可能具有一定的调节作用。
张有斌等[6]通过成功构建体内、体外都能稳定表达TIPE2的重组腺病毒载体，应用该载体使同种异体心脏移植大鼠受体内过表达TIPE2，能下调肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IFN-γ、IL-2表达水平，上调IL-4、IL-10的表达水平，减轻急性排斥反应，显着延长供体在受体内的存活时间。Sun等[9]在自身免疫性脊髓炎中明确证实TIPE2的负向免疫调节作用。有研究发现TIPE2+/+表达质粒明显提升大鼠佐剂型关节炎成纤维样滑膜细胞的TIPE2蛋白表达水平，TIPE2对DR5介导细胞凋亡有重要作用[10]。TIPE2是一种新发现的免疫负调控分子，优先表达在正常小鼠的髓系和淋巴系细胞，而在人体分布更加广泛。TIPE2可以调控T细胞受体和TLR的信号转导，从而对固有性免疫应答和适应性免疫应答进行免疫负调控，以便维持免疫自稳；TIPE2还可以通过直接结合caspase-8后，抑制激活蛋白-1和核因子-κB的活化等途径发挥其促细胞凋亡作用[2]。腺病毒相关载体则以其转染效率高，免疫原性低，长时稳定表达，定点整合无致癌隐患等独有的优势，在近些年的研究中得到了长足的发展[11]。AAV载体可操作性强，许多AAV已在临床中应用。因此，AAV-TIPE2载体在SLE及其他自身免疫性疾病中应用，将有着无限广阔的前景。
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Negative immune regulatory molecule TIPE2 for treating SLE mice through regulating macrophage subtype
LiXingjun1,ZhangYufen2,LiFeng2△,ZhuXiaohua2,HuangLan2
(1.DepartmentofClinicalLaboratory,ChongmingBranchHospital,AffiliatedXinhuaHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai202150,China; 2.DepartmentofDermatology,AffiliatedHuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China.)
Objective To investigate the role of tumor necrosis factor (TNF)-alpha-induced protein 8-like 2 (TIPE2) for regulating the macrophage polarization in systemic lupus erythematosus and its curative effects on experimental SLE mice.Methods The mice were treated with activated lymphocytes derived DNA (ALD-DNA) for inducing mice model,randomly divided into AAV-scr control group and AAV-TIPE2 experimental group,and injected with AAV-TIPE2 or AAV-scr virus solution from the tail vein of mice.The expression of TIPE2 mRNA and protein in polarized macrophages,serum dsDNA antibody titer,urine protein and renal pathological index were detected.Results (1) The TIPE2 expression level of TIPE2 mRNA and protein in AAV-TIPE2-transfected cells was 13.5±1.6 times and 10.8±1.6 times of AAV-scr control group respectively.(2) M2 macrophage specific molecule MGL+was 59.6% in AAV-TIPE2 group and MGL+cells in the AAV-scr group was 8.4%.M2/M1 odds ratio of AAV-TIPE2 experimental group to AAV-scr control group was 16.(3) The recombinant TIPE2 adenovirus related vector could stably expressed in transfected HEK-293.In vitro and in vivo experiments confirmed that AAV-TIPE2 was able to induce M2 polarization of macrophages in ALD-DNA-induced lupus mice.(4) The serum anti-dsDNA antibody,urinary protein and renal pathology in the AAV-TIPE2 group were significantly lower than those in the AAV-scr group(P<0.01).Conclusion TIPE2 alleviates the disease condition of ALD-DNA induced SLE mice through induction of macrophage polarization to M2 phenotype,which may be used as a promising therapeutic method for ALD-DNA induced SLE mice.
macrophages;systemic lupus erythematosus;adenoviridae;ALD-DNA;TIPE2
李星军(1967-)，副主任技师，硕士，主要从事临床免疫检验相关研究。△
，E-mail:lifengxr@sina.com。
10.3969/j.issn.1671-8348.2017.24.002
R751.05
A
1671-8348(2017)24-3318-03
2016-12-18
2017-03-06)
