耿娜娜，吴明松,，郑 翔，杨 蕾，王宏阳，李学英△
(1.遵义医学院口腔学院，贵州遵义 563000；2.贵州省高等学校口腔疾病研究特色重点实验室/遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州遵义 563000；3.遵义医学院医学遗传学教研室，贵州遵义 563000)
有研究显示，2015年中国肝癌男女新发病分别为343 700例和122 300例，其中男性死亡310 600例，女性死亡111 500例，占癌症相关死因的17.2 %和11.1 %[1]。原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)在我国发病率较高，其中肝细胞癌(hepatic carcinoma，HCC)占PLC的90%以上[2-3]。顺铂(cis-dichlorodiamine platinum，CDDP)是治疗HCC的主要药物之一，但其单药有效率比较低[3]，毒副作用也较大。研究表明，单宁酸(tannic acid，TA)可与其他药物协同发挥抗癌作用，如与丝裂霉素C、5-氟尿嘧啶联用抗胆管癌[4]，与三氧化二砷(As2O3)联用抗人类白血病[5]，与CDDP联用抗卵巢癌[6]等。此外，TA能够抑制人肝癌HepG2细胞的生长增殖[7-9]，但其分子机制尚不清楚。有研究表明口服TA较为安全，并被作为食品添加物[6]。因此，TA可能作为一种低毒的化疗药物增敏药物，参与癌症的预防和治疗。
内质网主要负责蛋白质的合成、修饰与转运、信号转导等，当这些过程受到干扰时，会导致蛋白质的折叠、翻译后修饰、基因表达等发生紊乱，从而引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[10]。ERS介导的细胞凋亡与众多癌症的发生、发展等有关联[11-12]。研究表明，CDDP能够通过激活ERS促进肝癌HepG2细胞的凋亡[13]。TA是否能够协同增强CDDP抗肝癌，并通过ERS途径诱导肝癌细胞凋亡，尚少见报道。本研究旨在探讨TA协同增强CDDP抗肝癌HepG2细胞的作用，并通过体外实验探索ERS凋亡通路在该协同效应中的作用。
1 材料与方法
1.1材料 人肝癌细胞株HepG2，来源于中国科学院细胞库。TA(C76H52O46，含量大于或等于95%)购自Sigma公司，CDDP注射液[Cl2(NH3)2Pt]购自山东齐鲁制药公司，RPMI-1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自浙江天杭生物科技有限公司，噻唑蓝(MTT)购自BBI公司，4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)购自Biosharp公司，M-MLV逆转录酶购自Promega公司，dNTP Mix(10 mmol/L)购自上海生工生物公司，RNAiso TM Plus购自TaKaRa Biotechnology公司，PCR引物(表1)由上海生工生物公司合成，Sso Fast Eva Green supermix实时荧光定量PCR(q-RT-PCR)试剂盒购自Bio-Rad公司，鼠抗人葡萄糖调节蛋白(glucose regulated protein，GRP)94单抗、兔抗人GRP78多抗和兔抗人β-actin单抗、辣根过氧化物酶标记的多抗均购自Protein-Tech Group公司。酶标仪Model 680、PCR仪CFX Connect TM Optics Module均购自Bio-Rad公司，倒置荧光显微镜IX73购自Olympus公司，超微量分光光度计Nanodrop 2000购自Thermo Scientific公司，GOLD-SIM二氧化碳培养箱购自西盟国际公司。
表1 PCR引物序列及扩增长度
1.2方法
1.2.1细胞培养 将人肝癌细胞系HepG2培养于含10% FBS、2.0 g/L NaHCO3、100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素的RPMI-1640培养基中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2～3 天传代1次。
1.2.2细胞的生长抑制作用 采用MTT法检测并计算细胞的存活率[14]。取对数生长期HepG2细胞接种于96孔培养板中，每孔1×104个。静置培养24 h后，分别加TA 0(对照组)、90.00、180.00、270.00、360.00、450.00、540.00 μmol/L和CDDP 0(对照组)、0.60、1.20、1.80、2.40、3.00、3.60 μg/mL，每组设5个复孔。继续培养24 h后，每孔加入10.00 μL浓度为5.00 mg/mL 的MTT溶液；再培养4 h后，弃上清液，每孔中加入100.00 μL二甲基亚砜，轻轻振荡10 min。用酶标仪测定570 nm波长下各样品的吸光度(A)值，各复孔的A取平均值，计算细胞的存活率，其中空白对照组细胞存活率记为100%。用等效线图解法观察TA和CDDP的协同作用，其中等效线图中的斜线为两种药物联合产生100%最大抑制效应时的相加等效线，当二者的剂量比例点位于等效线上时，表现为相加作用；位于等效线下方，表现为协同作用；位于等效线上方，表现为拮抗作用。药物的协同作用还可通过药物联合作用指数(combination index，CI)和药物剂量降低指数(dose reduction index，DRI)来判断[15]。以(D)1和(D)2表示两种药物联用达到某一特定生长抑制率时的使用浓度；(DX)1和(DX)2表示达到与联合用药相同的生长抑制率时，两种药物单独使用的浓度。CI<1表明药物具有协同作用；CI=1表明药物具有相加作用；CI>1表明药物具有拮抗作用。DRI表示在给定的抑制率下，与药物单独使用相比较，药物联合使用达到同一抑制率时，药物剂量所降低的倍数。计算公式如下：
细胞存活率(%)=(实验组A值-阴性对照组A值)/(空白对照组A值-阴性对照组A值)
(1)
CI=(D)1/(DX)1+(D)2/(DX)2
(2)
(DRI)1=(DX)1/(D)1
(3)
(DRI)2=(DX)2/(D)2
(4)
1.2.3细胞形态与细胞核变化的观察 DAPI是一种能够穿透细胞膜与核DNA结合的荧光染料，可用于检测细胞核的形态变化和细胞凋亡，正常的细胞核较为完整，染色质均匀；而凋亡细胞的染色质发生固缩，边缘化，严重时发生细胞核裂解，产生核碎片等。取对数期HepG2细胞接种于6孔板，每孔3×105个(接种约3.00 mL)。药物处理24 h后，经丙酮固定，DAPI染色后，于显微镜下观察细胞和细胞核的形态，并照相。
1.2.4q-RT-PCR检测 药物处理24 h后，收集细胞，提取细胞总RNA，根据试剂盒方法，逆转录合成cDNA。q-RT-PCR反应体系体积为10.00 μL，包括cDNA 1.00 μL、Sso Fast Eva Green supermix 5.00 μL，上游引物0.50 μL，下游引物0.50 μL，无菌水3.00 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性60 s；95 ℃变性20 s，56 ℃(GRP78和β-actin)或63.5 ℃(GRP94)退火30 s，40个循环周期。每个样品设置3管重复。以β-actin作为内参，采用2-△△CT的方法，用3次重复的平均值计算基因相对表达量。
1.2.5Western blot检测 药物处理24 h后，提取细胞总蛋白质，采用BCA法测定蛋白质的浓度，取一定体积量蛋白样品，进行变性、电泳、转膜、封闭、孵育一抗(GRP78 1∶2 000；GRP94 1∶2 000；β-actin 1∶10 000)和二抗(1∶2 000)、曝光与显影，晾干。
2 结 果
2.1TA与CDDP协同抑制肝癌细胞生长 TA和CDDP均能明显抑制HepG2细胞的存活率，且均呈剂量性依赖(P<0.01)，TA和CDDP的半数抑制率(IC50)浓度分别为360.00 μmol/L(TA组，图1A)和1.80 μg/mL(CDDP组，图1B)。采用两种药物IC50一半浓度的方法联合处理HepG2细胞，TA、CDDP组对HepG2的抑制率分别为(19.10±6.00)%、(17.50±4.00)%，而TA 360.00 μmol/L+CDDP 1.80 μg/mL(联合组)抑制率为(60.30±2.00)%，明显高于TA、 CDDP组(P<0.01)，见图1C。等效线图中TA与CDDP的剂量比例点绝大多数位于等效线下方(图1D)。不同剂量的TA与CDDP联用产生的抑制率为9.00%～70.00%(IC9～IC70)时，其CI分别为0.44、0.48、0.70、0.75、1.35，大多数均小于1；不同比例的TA与CDDP联用的DRI分为1.40～4.00和1.60～5.30，见表2。
A:单纯TA；B：单纯CDDP;C:二者联用；D：规范化等效线图解法；a：P<0.05，b：P<0.01，与对照组(0)比较；c：P<0.01，与联合组比较
图1不同剂量TA与CDDP对肝癌HepG2细胞生长的抑制作用
图2 各组肝癌HepG2细胞的形态及细胞核变化
表2 TA与CDDP的CI与DRI情况
2.2TA增加CDDP的促肝癌细胞凋亡作用 凋亡细胞的基本形态变化主要有：细胞体变小、变圆，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞质浓缩，折光度降低等。药物处理24 h后，对照组细胞贴壁良好，呈梭形或多角形，轮廓较为清晰，折光度均一；TA、CDDP组部分细胞开始脱壁，细胞体积皱缩、变圆，折光度降低；联合组出现大量脱壁死亡细胞和细胞碎片，折光度明显降低。药物处理24 h后DAPI染色显示，对照组细胞核较为完整，为椭圆形或圆形，染色质较为均匀，呈淡蓝色；TA组、CP组部分细胞核固缩，出现大小不同的核裂解碎片(凋亡小体)；而联合组多数细胞核固缩，细胞染色质聚集，部分细胞核边缘呈现不规则，染色较深，呈现蓝色荧光，出现更多的凋亡小体，表现出典型的细胞凋亡形态学变化，见图2。
2.3TA与CDDP协同上调肝癌细胞ERS水平 药物处理24 h后，联合组细胞GRP78、GRP94 mRNA及蛋白的表达量明显高于TA、CDDP组(P<0.05)，见表3、图3。
表3 各组GRP78、GRP94 mRNA及蛋白水平比较
a：P<0.01，与对照组比较；b：P<0.01，c：P<0.05，与联合组比较
图3 各组肝癌HepG2细胞GRP78和GRP94蛋白表达
3 讨 论
本研究发现TA与CDDP单独用药均能够抑制HepG2细胞的生长增殖，且均呈剂量性依赖；当使用二者IC50的一半浓度进行联合用药后，上述效应加剧，抑制率明显高于各单药组，表明TA与CDDP具有协同抗HepG2的作用。等效线图解法、CI、DRI，细胞及细胞核的形态学观察结果进一步证明了二者的协同作用。已有研究表明，药物产生的毒副作用主要与用药剂量密切相关，因此通过降低药物使用剂量能够降低其毒副作用[16]，TA与CDDP 的协同抑制HepG2细胞的作用，能够降低CDDP的使用剂量，减少其毒副作用，并且TA本身毒性较低，可作为CDDP的增敏药物，参与癌症的预防和治疗，作者认为TA具有潜在的临床应用价值。
当环境因素极大地扰乱内质网动态平衡的过程时，内质网将进行应激，并激活各种ERS反应。一方面，内质网会启动各种调节机制以减轻这些损伤，使细胞适应环境的胁迫，以促进细胞的存活；另一方面，如果细胞无法适应环境的胁迫，长时间的ERS将会引起细胞凋亡的发生[17-18]。GRP78和GRP94是内质网蛋白的分子伴侣，被认为是ERS的标志性分子。GRP78，即相对分子质量为78×103调节血糖的蛋白，也被称为ERS传感器结合免疫球蛋白(the immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)。GRP94是另一种主要的GRP，相对分子质量为94×103。在非ERS状态下，GRP78与蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、肌醇酶1α(IRE1α)、激活转录因子6(ATF6)形成稳定的配合物，并保持无活性状态[19]。GRP78通过阻止PERK和IRE1α二聚体的形成，来抑制其活性[19]；与ATF6结合阻断高尔基体定位信号，使ATF6稳定结合在内质网膜，阻止ATF6的进一步激活[20]。在ERS状态下，内质网中积累的错误折叠蛋白与GRP78蛋白竞争，使GRP78从PERK、IRE1α和ATF6 上解离，从而失去其抑制作用，引起下游相关信号转导[20]。
ERS介导的细胞凋亡与众多癌症的发生、发展等有关。癌细胞自身创造的低氧、低pH值和低营养等不利的微环境都有助于引起ERS。但癌细胞能够通过多种方式去适应这种环境应激，以阻止ERS诱导的细胞凋亡相关信号途径[18]。当癌细胞无法适应环境的胁迫，持续的ERS将会诱导癌细胞凋亡的发生，如MESE等[21]研究发现GRP78表达上调能够使人表皮细胞癌A431细胞株对CDDP的敏感性增强。王涛等[22]研究发现GRP94表达上调能够增加肺癌细胞株NCI-H460对CDDP的敏感性。本研究显示，用药24 h后，TA、CDDP组与联合组GRP78和GRP94表达均有所上调，且联合组上调最高，表明ERS是TA和CDDP协同促进HepG2细胞凋亡的靶点之一。其机制可能是TA通过阻断蛋白质从内质网到高尔基体之间的运输，诱导HepG2细胞的ERS 水平升高，高水平的ERS通过激活PERK-ATF4、IRE1α-XBP1和ATF6信号通路来抑制细胞DNA修复酶的活性，从而协同性增加CDDP对癌细胞的DNA 损伤作用[23-25]，最后激活Caspase 蛋白家族级联反应[26]，诱导细胞凋亡的发生。然而，关于ERS 的PERK-ATF4、IRE1α-XBP1和ATF6 信号通路激活的具体分子机制有待进一步研究。
综上所述，TA和CDDP能够协同增强肝癌HepG2细胞的凋亡，其协同作用与ERS途径的激活有关，为TA与CDDP应用于临床治疗肝癌提供了理论基础。
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