唐 静，贾昱娴，农 丽，覃芳卉，钟武宁，谭爱花，刘 燕，王洪学，王 涵，谢伟敏，陆永奎，周文献
(广西医科大学附属肿瘤医院乳腺及骨软组织肿瘤内科，南宁 530021)
乳腺癌是分子水平表达高度特异的一类疾病，其中一种分子亚型为三阴型乳腺癌(TNBC)。该类型乳腺癌雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)均为阴性，是疗效和预后较差的乳腺癌亚型之一[1]。探寻其发病机制和潜在的生物治疗靶点成为近年来的热点。低氧诱导因子-1(HIF-1)是目前所发现的唯一特异在低氧条件下介导细胞反应的核转录因子。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成的异二聚体，其中β亚基不受氧的调节和影响，而α亚基是缺氧诱导的,是调节活性的功能亚基。研究证实,HIF-1α在肿瘤组织中大量表达,不仅与肿瘤组织的血管生成、能量代谢、侵袭转移、放疗抵抗性相关，还与药物耐药性相关[2]。在缺氧条件下肿瘤组织中的HIF-1α上调使肺腺癌转移相关转录本-1(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1)基因启动子甲基化，使其在增殖的肿瘤细胞中异常表达[3]。MALAT-1属lncRNA家族重要成员之一，长度约8.7 kb，基因位于人染色体11q13.1，具有高度保守的核苷酸序列。以往文献报道，MALAT-1在乳腺癌中异常表达，参与乳腺癌细胞的迁移、侵袭及克隆增殖[4-5]。但目前有关两者在TNBC的表达与临床病理特点相关性的研究报道较少。本研究检测TNBC患者癌组织标本及其对应癌旁组织标本中MALAT-1、HIF-1α mRNA的表达情况，且分析其与TNBC的临床特征关系。本研究了解MALAT-1、HIF-1α在TNBC的发生、发展中的作用，希望为TNBC患者的个体化治疗提供新的靶点。
1 材料与方法
1.1标本收集 收集广西医科大学附属肿瘤医院2013年1月至2014年6月33例患者手术切除的TNBC及癌旁组织标本，患者均为女性，年龄31～69岁，随访至2016年6月。肿瘤临床分期Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期12例。标本保存于-80 ℃冰箱中。
1.2 方法
1.2.1染色方法 采用免疫组织化学SP法。对33例TNBC癌组织及癌旁组织依次进行低聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，脱蜡，水化，抗原修复，血清封闭，然后进行兔抗人HIF-1α多克隆抗体一抗4 ℃孵育过夜。取出标本后按说明书加入二抗。二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，冲洗反蓝。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。
1.2.2结果判定 采用染色强度与阳性细胞百分数相结合的判读标准。采用双盲法判定染色结果。HIF-1α阳性定位在细胞核或细胞质中。细胞核或细胞质无染色或轻微染色判为阴性。细胞核或细胞质有较强染色，且阳性细胞数比例大于或等于50%，或者细胞核或细胞质强染色，且阳性细胞数比例大于或等于10%判读为阳性。
1.2.3引物设计与合成 使用美国国立生物技术信息中心网络查询到相应基因的mRNA序列，用引物设计软件Premier5.0设计相应基因引物，并用OLIGO 7.0对引物的可行性进行评估。内参选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。所有引物选择聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)纯化级别，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：MALAT-1上游引物5′-TGC CCA TTC ACT GCC TCC T -3′，下游引物5′-TGC CGA CCT CAC GGA TTT T-3′，扩增产物片段长度为93 bp。HIF-1α上游引物5′-TCC AAG CCC TCC AAG TAT-3′；下游引物5′-ATG CTA AAT CGG AGG GTA-3′，扩增产物片段长度为568 bp。
1.2.4实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测 Trizol法提取总RNA，操作按说明书进行，采用ND-2000C微量紫外分光光度计测定总RNA浓度。反转录反应(TaKaRa公司产品)：2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、500 ng总RNA、加入10 μL RNase Free ddH2O。然后在PCR仪42 ℃水浴2 min。按顺序加入1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ、1.0 μL RT Primer Mix、4.0 μL 5×PrimeScript Buffer 2、4.0 μL RNase Free ddH2O、总体积20 μL。37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。水浴1～2 min。反转录合成的cDNA在-80 ℃中保存用于PCR。PCR总反应体积为20 μL，包括SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，QNRox Reference Dye 0.2 μL，上下游引物各2 μL，CDNA模版2 μL，RNase-Free水6.8 μL。循环参数：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共循环40次。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分离，并采用自动电泳凝胶成像分析仪及分子分析软件进行图像扫描和分析。将目的基因的mRNA实际表达水平与GAPDH mRNA实际表达水平比较，用2-△△CT法得到MALAT-1、HIF-1α mRNA相对表达水平。
2 结 果
2.1HIF-1α蛋白在癌组织及癌旁组织阳性表达情况 在33例TNBC组织中，有23例阳性表达HIF-1α蛋白,10例阴性表达HIF-1α蛋白；33例癌旁组织中，有15例阳性表达HIF-1α蛋白，18例阴性表达HIF-1α蛋白，TNBC组织的HIF-1α蛋白阳性表达率(69.7%)明显高于癌旁组织(45.4%)，差异有统计学意义(χ2=3.97,P<0.05)。
2.2MALAT-1、HIF-1α在癌组织及癌旁组织的表达情况 TNBC组织的MALAT-1的RNA表达水平为2.62±0.23，癌旁组织的表达水平为2.02±0.08，两组间比较差异有统计学意义(t=12.73，P<0.05)。TNBC组织的HIF-1α的RNA表达水平为129.79±15.34，癌旁组织的表达水平为43.46±5.14，两组间比较差异有统计学意义(t=32.48，P<0.05)。
表1 乳腺癌组织中的MALAT-1、HIF-1α的RNA表达量与临床病理参数的相关
2.3TNBC组织中的MALAT-1、HIF-1α的RNA表达水平与临床病理参数的相关性 33例TNBC患者有5例分化程度Ⅰ级，16例Ⅱ级，12例Ⅲ级；15例没性有淋巴结转移，18例淋巴结转移阳性；浸润深度Tis～T1有10例，T2有14例，T3～T4有9例；临床分期Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期12例。随访期间出现复发14例，没有出现复发19例。癌组织中的MALAT-1、HIF-1α mRNA的表达水平与TNBC的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、临床分期相关，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
3 讨 论
由于TNBC作为乳腺癌的一种分子亚型，其复发率高，耐药性及易转移的特点是该疾病预后差的主要因素，目前临床上尚无对于TNBC有效的治疗措施。TNBC肿瘤生长微环境的机制尚不清楚。如何选择靶点进行靶向治疗成为TNBC治疗的关键和难点。缺氧微环境常见于快速生长的肿瘤组织中。在肿瘤微环境中，肿瘤新生血管无法满足无限增殖的肿瘤细胞，导致细胞氧浓度下降，脯氨酸羟化酶、天冬酰氨胺羟化酶失活，进而激活下游靶基因HIF-1α转录。HIF-1α通过与低氧反应元件结合，激活下游靶基因转录表达[6]。现已发现HIF-1α可以激活多种靶基因产物，并且大多数靶基因在肿瘤组织的血管生成、能量代谢、侵袭转移中扮演重要角色[7]。
MALAT-1是第一个被证实与肿瘤转移和预后有关的lncRNA，其高表达与早期非小细胞肺癌术后转移密切相关[8]。研究表明MALAT-1 lncRNA在MCF-7乳腺癌细胞缺氧条件下高度表达[9]。研究证实MALAT-1在多种肿瘤组织出现异常表达，可能参与肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡、迁移及侵袭等过程[10-12]。
本研究结果表明，HIF-1α蛋白、MALAT-1、HIF-1α RNA在TNBC癌组织的表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，提示MALAT-1、HIF-1α RNA的异常表达可能参与了TNBC的发生、发展过程，与近年来相关文献报道一致[13-18]。提示乳腺癌组织中HIF-1α蛋白、MALAT-1、HIF-1α RNA的表达可作为其向恶性转化的一个标准。
本研究显示 MALAT-1、HIF-1α RNA在TNBC的表达与浸润深度、分化程度、淋巴结转移、临床分期相关,提示MALAT-1、HIF-1α可能在TNBC发生、发展和浸润转移过程中发挥了一定的作用,并有可能提示预后，与近年来相关文献报道一致[19-22]。文献报道，已有基于HIF-1的靶向治疗处于试验阶段，利用 HIF-1为靶点的基因治疗主要有反义核酸技术和RNA干扰。其中代表药物有miR-20b、EZN-2968，均可以抑制肿瘤HIF-1α的表达，将在未来进入临床阶段[23]，有望为TNBC找到新的有效的靶向治疗途径。本研究显示,MALAT-1、HIF-1α RNA在TNBC中的表达与浸润深度、分化程度、淋巴结转移、临床分期具有相关性。
本研究尚有许多不足之处,比如样本量较小,有一定的局限性,MALAT-1和HIF-1α的作用机制缺乏分子水平实验支持,有待在后续实验中进一步补充。
