二甲亚砜对心脏毒性作用的机制研究*

邱全友，张 娟，范新荣，何容芳，高小丽，范泽楠，李妙龄△

(1.内江市中医医院麻醉科，四川内江 641000；2.医学电生理教育部重点实验室/四川省心血管预防和治疗协同创新中心/西南医科大学心血管研究所，四川泸州 646000；3.西南医科大学附属医院心血管内科，四川泸州 646000)

二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)是一种高极性的双亲性分子，是应用最广泛和最有效的化学溶剂或载体，被称为“万能溶剂”。DMSO还广泛作为渗透性保护剂，能降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减少自由基对细胞的损伤，改变生物膜对电解质、药物和代谢产物的通透性。另外，DMSO对心血管和神经系统还具有一定的治疗作用，有研究报道在冠状动脉左前降支结扎导致的心肌缺血大鼠模型上，低剂量的DMSO可降低血管阻力和增加心排血量[1]。而在作为广谱溶剂时，其不良反应常被忽略。早在1995年OGURA等[2]研究发现，DMSO浓度依赖性地延长豚鼠乳头肌动作电位时程，降低动作电位0期最大上升速度(Vmax)。也有研究显示，眼内注射5 μL浓度大于1%的DMSO可明显导致大鼠视网膜神经节细胞发生凋亡，且呈剂量依赖性[3]。在视网膜神经节细胞株细胞上也同样发现DMSO浓度在2%(w/v)及以上可浓度依赖性地降低细胞的存活率，其半数抑制浓度为2.14%(w/v)。另有研究也证实，实验室常用的DMSO可在体内低温条件下间接增加Tau蛋白的磷酸化或直接在体外明显增加Tau蛋白的磷酸化[4]。DMSO作为一种溶剂，通常还被用作骨髓和器官移植的冷冻保护剂。HANSLICK等[5]研究发现，DMSO可导致不同年龄的小鼠大脑神经细胞发生凋亡。在体外大鼠海马神经元细胞培养条件下，0.5%和1.0%的DMSO可导致神经元的减少，这表明DMSO可导致细胞毒作用。DMSO在神经系统具有一定的毒性，但在心血管系统实验研究中需经常应用DMSO作为药物的溶剂，因此，针对心脏及心肌细胞，明确其最小的安全浓度具有重要的意义。因此，本研究以新生大鼠的心肌细胞和离体灌流的豚鼠心脏为研究对象，探究不同浓度的DMSO对心肌活力和心脏功能的影响，寻找DMSO溶剂的安全有效的浓度范围，为心血管疾病的基础与临床研究提供有效的保障。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 无特殊病原体(SPF)级健康成年豚鼠12只，体质量250～300 g；乳大鼠(出生1～3 d)25只，购于西南医科大学动物实验中心。

1.1.2主要试剂 DMSO购于美国Sigma公司，CCK8试剂盒购于碧云天试剂公司。

1.2方法

1.2.1不同浓度DMSO对心肌细胞存活率的测定 新生1～3 d的乳大鼠25只分5次进行培养。新生大鼠置于75%乙醇中消毒，仰卧位固定，开胸迅速取出心脏，将心脏剪成3～4块后，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗心肌组织内的淤血2～3次，再将心肌组织置于0.25%胰酶中4 ℃过夜；将过夜后的心肌组织用PBS清洗后置于37 ℃恒温的酶液(Ⅱ型胶原酶1 mg/mL+牛血清清蛋白5 mg/mL)中消化约15 min，离心后接种于10 cm培养盘于培养箱内培养2 h，此时成纤维细胞已贴壁，再将心肌细胞悬液接种于96孔板内培养24 h，每个处理因素设4个复孔。DMSO按体积比0(对照)、0.03%、0.30%、1.00%、3.00%、10.00%加入，再培养24 h后终止培养，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h，用酶标仪在450 nm处检测每孔的吸光度值(A值)，每组4孔取平均值，按公式计算细胞存活率：细胞存活率=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)，每组重复5次。

1.2.2Langendorff灌流豚鼠心脏检测DMSO对心率、心电图和室内压的影响 豚鼠雌雄不限，肝素1 000 IU/kg腹腔注射20 min后，用1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后快速取出心脏，分离主动脉后迅速将主动脉固定于Langendorff灌流装置上(注意插管不宜过深，0.5～1.0 cm)，再用氧饱和的含钙(CaCl21.8 mmol/L)台式液恒流、恒温(37 ℃)灌流心脏，整个灌流过程中尽量不要有气泡，灌流20～30 min待心脏灌流液清亮，心脏收缩平稳后于左心耳根部剪一小切口将制备好的球囊经左心房、房室瓣固定于左心室内，球囊远端与AD instruments电生理仪相连的压力传感器相连。通过连接于三通管上的注射器向心室内球囊缓慢注射适量的台式液，以调整左心室的舒张末期压力，且灌流速度控制在6 mL/min左右。左心室球囊固定好后，于心尖处和主动脉根部分别固定心电记录电极的正负极，电极远端连于电生理仪的心电导联接口，通过电生理记录软件同步记录不同浓度DMSO[0(对照)、0.03%、0.10%、0.30%、1.00%、3.00%、10.00%，每个浓度给药时间为10 min]对豚鼠心室内压、心电图和心率的影响。通过AD instruments电生理记录软件分析DMSO对左心室发展压(LVDP，LVDP=左心室收缩压-左心室舒张压)、左心室内压最大上升速率(dp/dtmax)和左心室内压最大下降速率(dp/dtmin)的影响。通过记录的心电图分析心率、PR段、QRS波、QTc和ST段的变化。

2 结 果

2.1DMSO对乳鼠心肌细胞活性的影响 乳大鼠心肌细胞培养24 h后，给予不同浓度DMSO(0、0.03%、0.10%、0.30%、1.00%、3.00%、10.00%)培养24 h后，镜下可观察到随着DMSO浓度的增加心肌细胞的数量逐渐减少，见图1A。CCK-8结果显示3.00%、10.00%的DMSO均明显减少心肌细胞的存活率，见图1B。

2.2DMSO对Langendorff灌流豚鼠心率和心电图的影响 Langendoff灌流豚鼠心脏上固定好检测室内压的球囊和心电检测电极后，待室内压力稳定，可同步记录室内压、心率和心电图。给予不同浓度的DMSO(0、0.03%、0.10%、0.30%、1.00%、3.00%、10.00%，每个浓度按6 mL/min速度持续给药10 min，n=12)，给药过程持续记录。结果显示，DMSO浓度依赖性地抑制心率，对照组的心率为(215.23±5.34)次/分钟，0.30% DMSO作用后的心率为(214.42±3.16)次/分钟；3.00% DMSO作用后的心率为(204.67±3.75)次/分钟，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而10.00% DMSO作用后的心率降至(191.41±2.98)次/分钟，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

心电图分析结果显示，不同浓度的DMSO对QRS波宽和QTc间期没有明显的作用。10.00% DMSO可导致ST段形态的改变，ST段的抬高或压低；10.00% DMSO还可导致ST段明显延长，与对照组相比，ST段时长由(0.44±0.13)ms增加到(0.90±0.21)ms(n=12，P<0.01)。10.00% DMSO还可使T波形态发生明显的改变，由原来的钝圆形变为高尖的T波，见图3。

A：不同浓度DMSO作用24 h后的细胞形态学变化；B：不同浓度DMSO处理细胞24 h后CCK-8检测的细胞存活率；*：P<0.05，**：P<0.01，与对照组比较;1:对照组;2:DMSO 0.03%;3:DMSO 0.10%;4:DMSO 0.30%;5:DMSO 1.00%;6:DMSO 3.00%;7:DMSO 10.00%

图1不同浓度的DMSO对心肌存活率的影响(n=5)

2.3DMSO对Langendorff灌流豚鼠心脏功能的影响 Langendorff恒流恒温灌流豚鼠心脏后，固定好心电电极和左心室内球囊电极，待心室内压力和心电稳定30 min后给予不同浓度的DMSO(0、0.30%、3.00%、10.00%，每个浓度6 mL/min，持续给药10 min后浓度梯度连续给药，n=12)，观察DMSO对心脏功能的影响，结果显示，对照组的LVDP为(38.34±1.27)mm Hg，0.30% DMSO作用后的LVDP为(38.21±1.16)mm Hg，3.00% DMSO作用后的LVDP为(33.54±1.54)mm Hg，10.00% DMSO作用后的LVDP为(31.81±1.32)mm Hg，DMSO浓度依赖性地抑制LVDP，见图4。DMSO浓度超过3.00%可明显抑制豚鼠LVDP，同时DMSO浓度大于3.00%可明显抑制dp/dtmax，而对dp/dtmin没有明显的抑制作用，见图5。

*：P<0.05，**：P<0.01，与对照组比较；1：对照组;2：0.30% DMSO;3：3.00% DMSO;4:10.00% DMSO

图2 DMSO对离体灌流豚鼠心脏心率的影响(n=12)

A：对照组；B：0.30% DMSO；C：3.00% DMSO；D：10.00% DMSO

图3 DMSO对离体灌流豚鼠心脏心电图的影响(n=12)

A：对照组；B：0.30% DMSO；C：3.00% DMSO；D：10.00% DMSO

图4 DMSO对Langendorff灌流豚鼠心脏LVDP的影响(n=12)

A：LVDP；B：dp/dtmax；C：dp/dtmin；*：P<0.05，**：P<0.01，与对照组比较；1：对照组;2：0.30% DMSO;3：3.00% DMSO;4:10.00% DMSO

图5 DMSO对Langendorff灌流豚鼠心脏功能的影响(n=12)

3 讨 论

DMSO因具有特殊溶媒效应且易于溶解多种不易溶于水的物质，故被称为“万能溶剂”。DMSO应用极为广泛，是最为常见的溶剂之一，然而也有研究发现DMSO具有一定的细胞毒性。有研究显示，浓度大于0.25%的DMSO对Min6胰岛细胞的活力具有抑制作用[6]；DMSO对体外培养的眼组织也有一定的毒性[7]；DMSO浓度大于0.6%可显着影响胚胎的发育[8-9]；DMSO剂量依赖性地对耳蜗毛细胞具有毒性作用[10]。DMSO大于0.8%可明显抑制骨髓瘤细胞增殖，促进细胞凋亡[11]。也有研究发现，DMSO对Langendorff灌流的心肌具有正性或负性肌力作用，可抑制神经传导速度，抑制钠钾泵的活性[12]。在C57BL/6小鼠的体内(0.3 mL/kg)和体外实验(0.5%和1.0%)中均证实DMSO可导致海马神经元的细胞凋亡。DMSO具有对海马脑片的抗谷氨酸神经毒性作用[13-14]。抗心律失常药物多数不溶于水，以DMSO作为溶剂，因此研究DMSO对心肌功能的影响尤为重要，有利于正确评价心血管药物及其他药物的有效性和细胞毒性。

本研究证实，浓度大于3.00%的DMSO作用24 h后可明显抑制体外心肌细胞培养条件下的心肌细胞存活率，且具有明显的浓度依赖性。随着DMSO浓度的增高不仅心肌细胞的存活率降低，而且心肌细胞的数量也明显减少，死亡细胞逐渐增多。这些结果表明，浓度超过3%的DMSO对心肌细胞有一定的毒副作用，在使用DMSO的过程中浓度应尽量低于3%，<1%相对安全。而在作为溶剂用于心血管系统的研究中也需要特别注意DMSO的浓度，在溶质能溶解的条件下，尽量减少DMSO的量，DMSO不仅本身会影响心肌细胞的活性，减少心肌细胞的数量，而且可导致渗透压的变化，也会影响心肌细胞的活性。已有研究证实，DMSO确实能改变灌流心脏台式液的渗透压，1% DMSO可导致渗透压升高1.5倍[2]。也有研究表明，在视网膜神经元细胞系细胞上发现DMSO浓度大于1%明确具有细胞毒性，可导致神经细胞的损伤[3]。

在Langendorff灌流的豚鼠心脏上，本研究发现3.00%和10.00%的DMSO均能明显降低豚鼠心率、LVDP和dp/dtmax。LVDP和dp/dtmax主要反映左心室的收缩功能，dp/dtmin主要反映左心室舒张功能。本研究结果表明，浓度超过3%的DMSO可通过减慢心率，降低室内压来明显降低心脏的收缩功能。而且，早在1995年就有研究发现5% DMSO可延长豚鼠乳突心室肌动作电位时程(APD)，15%、10% DMSO可延长APD达33%。相反，MAN等[15]发现DMSO(0.2%～0.8%)预处理可降低过氧化氢诱导的心肌细胞的损伤，降低心肌细胞的存活率，减少心肌细胞的凋亡和降低半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的表达。本研究还发现DMSO浓度在高达10.00%时可致ST段延长，ST段和T波形态发生改变，这表明DMSO可能会导致心肌损伤或心肌缺血。

有关DMSO对心肌的损伤影响的研究较少，本研究结果与MAN等[15]的结果不一致可能是由于DMSO浓度范围的差异。低浓度的DMSO(一般情况小于1.00%)可能具有一定的降低损伤心肌凋亡的作用，但超过1.00%，特别是高于3.00%可明显降低心肌的存活率、减慢心率和降低室内压，增加心肌的损伤。因此DMSO作为溶剂时需严格控制其浓度，以减少DMSO对心脏功能的影响。