祝 文，崔 凤，程志坚△，贺西京
(1.陕西省咸阳市第一人民医院重症医学科 710021；2.西安交通大学医学院第二附属医院骨科 710004)
巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，在多种神经系统疾病中发挥重要作用越来越受到研究者的重视[1-2]，尤其是以炎性反应为主的病理变化，其在抗感染和免疫调节中均起着非常重要作用[3-5]。巨噬细胞主要来源骨髓，如何分离、原代培养获得高纯化骨髓来源的巨噬细胞，并充分了解其生长特性，是体外研究巨噬细胞功能的首要任务。目前，关于骨髓来源巨噬细胞培养相对成熟，但是关于培养过程中其标志物及增殖能力情况鲜见具体描述。本研究拟以小鼠骨髓来源的巨噬细胞研究对象，重点探索培养不同时间点细胞表达巨噬细胞标志物和增殖动态情况，给以巨噬细胞为靶点的相关后续研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物和细胞 本实验所使用的实验动物是SPF级6～8周龄成年昆明小鼠，由西安交通大学医学院动物实验中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。小鼠成纤维细胞株L929购自中科研究细胞库。
1.1.2主要试剂和仪器 培养基高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、胰酶购自美国GIBCO公司，新生牛血清(NCS)购自美国Cellgro公司，大鼠抗小鼠 F4/80 抗体、5′-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)增殖检测试剂盒购自美国Abcam公司,相应的山羊抗大鼠Alexa Fluor 488染料标记的荧光二抗购自美国Life technologies公司,红色荧光beads、Hoechst33342荧光染料购自美国Sigma公司，荧光显微镜日本尼康公司，二氧化碳细胞培养箱购自美国Thermo公司。
1.2方法
1.2.1L929细胞培养及其上清液的收集 L929细胞培养于含10% NCS的DMEM(高糖)培养液约7 d后，收集培养上清液，3 500 r/min 4 ℃离心30 min，去除沉淀(即细胞碎片)，然后用0.45 μm滤器过滤后，所得液体为含集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)-1的培养液，用于配制骨髓来源巨噬细胞培养液，分装后保存于-80 ℃备用。
1.2.2骨髓内细胞的分离及培养 将6～8周龄昆明小鼠处死后，无菌条件下取其股骨及胫骨置于预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)中。转移于超净台内，全程于冰袋上操作。剔除周围的肌肉组织，然后将两端干骺端去除，用巨噬细胞条件培养液将骨髓从髓腔中冲洗出，并将其吹打成均匀的单细胞悬液，以(1～3)×107个/皿的密度接种于10 cm Petri培养皿中。细胞所用培养基为：DMEM+15%L929上清液+5%NCS+1%青霉素链霉素(Gibco,15140122)置于37 ℃孵箱中培养。从接种时开始，每隔3 d全量换培养液。
1.2.3F4/80细胞免疫荧光染色 按照培养1、3、5、7 d不同时间点收集相应细胞爬片并固定，然后用1%牛血清清蛋白(BSA)+0.3% Triton X-100封闭1 h，分别加大鼠抗F4/80抗体(1∶400)，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤5 min×3次，二抗Alexa Fluor®488山羊抗大鼠抗体(1∶600)，室温、避光孵育1 h并使用Hoechst33342(1∶1 000)染核5 min，PBS洗涤后封闭、荧光显微镜观察并分析结果。
1.2.4吞噬实验 检测培养7 d后巨噬细胞吞噬功能,加入 Beads 1 h后洗涤、固定、荧光显微镜拍照并分析结果。
1.2.5EdU标志法检测增殖情况 固定标本前2 h添加10 mmol/L EdU孵育细胞，再固定、破膜30 min，然后根据说明配制EdU反应溶液，避光反应30 min，染核、洗涤、封片、观察及分析结果。
2 结 果
2.1细胞形态学观察结果 获取的小鼠骨髓细胞在含15%L929上清液巨噬细胞培养液中培养7 d后，细胞在显微镜下观察，细胞形态不均一，可呈棱形、短杆状或椭圆形等(图1A)，利用免疫荧光染色可观察到所获得细胞的巨噬细胞标志物F4/80阳性率高达95%(图1B)，且具吞噬能力，见图1C。
2.2培养过程中细胞F4/80及EdU阳性细胞表达比较 骨髓细胞在含15%L929上清液的培养液中培养7 d后可获得高纯度的巨噬细胞(即F4/80阳性细胞)，培养1、3、5、7 d后细胞F4/80阳性细胞率分别为(1.52±0.39)%、(17.95±2.36)%、(75.57±6.17)%、(95.49±9.83)%，各时间点F4/80阳性细胞率比较差异均有统计学意义((1 dvs. 3 d、3 dvs. 5 d、5 dvs.7 d)，P<0.05)；培养1、3、5、7 d后细胞EdU阳性细胞率分别为(2.13±0.33)%、(4.61±0.54)%、(18.02±2.19)%、(28.84±3.15)%，各时间点EdU阳性细胞率比较，差异均有统计学意义(1 dvs.3 d、3 dvs.5 d、5 dvs.7 d，P<0.05)。随着培养时间延长，F4/80及EdU阳性细胞表达率逐渐升高，见图2、3。
A：巨噬细胞形态；B：F4/80阳性表达；C：细胞吞噬能力
图1显微镜下观察培养7 d的巨噬细胞形态F4/80阳性表达及吞噬能力(×100)
图2 不同时间点体外培养细胞F4/80免疫荧光染色结果(×100)
图3 不同培养时间骨髓细胞EdU免疫荧光染色结果(×100)
3 讨 论
巨噬细胞分布在全身，其分为组织内巨噬细胞和外周循环的巨噬细胞。在正常生理状态下，巨噬细胞监视组织内环境，如吞噬病原体维持组织稳态，吞噬死亡细胞，对局部环境的变化会做出迅速的反映。许多疾病如脊髓损伤、肿瘤、动脉粥样硬化、哮喘都与巨噬细胞息息相关，其也是主要治疗靶点[3,6]。因此，巨噬细胞是研究细胞免疫、分子免疫学等方面的重要对象。充分了解巨噬细胞生长特性是体外研究巨噬细胞功能的重要任务之一，目前关于骨髓来源的巨噬细胞体外培养过程中其标志物及增殖能力情况鲜见报道。
本研究中关注小鼠骨髓来源的巨噬细胞培养及培养过程中不同时间点巨噬细胞标志物表达和增殖能力动态变化情况，F4/80是常用巨噬细胞的标志物，主要表达于细胞膜[7]。骨髓细胞在15%L929上清液的培养液中培养7 d后，经鉴定其表达F4/80,并且具有吞噬能力，说明骨髓来源的巨噬细胞在体外成功培养，并且其纯度高，可满足实验条件，为以后进一步研究巨噬细胞在肿瘤、纤维化等疾病中的作用奠定了良好的基础。培养1、3、5、7 d不同时间点F4/80阳性细胞率比较差异有统计学意义(P<0.05),随着培养时间延长，F4/80阳性率逐渐升高，并在培养7 d达到(95.49±9.83)%。由此可见体外诱导时间是获得高纯度巨噬细胞的必要条件，一般要至少培养7 d，不能提前使细胞进行实验，否则会影响实验结论。因此，以巨噬细胞为研究对象时，需要保持培养时间恒定，才能获得相对一致结果。
本实验中经过7 d诱导培养后细胞形态多样，有着突起和伪足，符合体内巨噬细胞的特征，结合F4/80染色结果显示，体外经过含15%L929上清液诱的培养液诱导培养7 d能够成功获成熟的巨噬细胞。目前，用于巨噬细胞体外诱导大多是直接使用重组的巨噬细胞CSF，但对于需要大量培养巨噬细胞的课题如外泌体的分离等，则花费较大。而L929可以分泌大量CSF-1,使用L929上清液进行巨噬细胞培养具有获取简单、花费少、方便保存等优点。
过去认为组织中的巨噬细胞是已经分化成熟的终末细胞，不再具备增殖能力[8]。最新研究表明，巨噬细胞的原位增殖现象不仅仅在Th2型炎性反应发生过程中[9-11]，在其他巨噬细胞极化过程也可观察到巨噬细胞原位增殖现象，如肥胖造成的慢性炎症过程中[12]，以及动脉粥样硬化的发生过程中[13]，均观察到原位增殖巨噬细胞的存在。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中，通过基于Apollo®荧光染料与EdU的特异性反应即可直接并准确地检测出DNA复制活性。有研究发现，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞增殖情况[14-15]。本课题组的研究结果表明，培养7 d后获得骨髓来源的巨噬细胞部分表现EdU阳性，具有增殖能力。可见体外培养巨噬细胞可能存在两种来源：骨髓细胞诱导成熟和巨噬细胞自身增殖，本研究发现将给后续研究工作提供新的方向，下一步将对具有增殖能力的巨噬细胞进行分选和功能研究。
综上所述，利用含L929上清液的培养液经7 d诱导培养后，可从骨髓中获得高纯度的巨噬细胞，并且具有较强的增殖能力。
