益肾化湿颗粒通过RhoA/ROCK1信号通路对糖尿病肾病炎症的影响*

陈艳霞，涂卫平，房向东，柯 本，龙 脉，黄金菁

(南昌大学第二附属医院肾脏内科，南昌 330006)

传统上认为糖尿病肾病是血流动力学和代谢因素相互作用的结果，但研究发现糖尿病肾病动物模型和糖尿病肾病患者中循环炎性因子的表达明显上调，免疫细胞浸润增加，黏附分子和趋化因子水平表达增加[1]，表明炎症参与糖尿病肾病的发生及进展。目前关于糖尿病肾病的研究表明其发病机制是多因素的，其中免疫反应和炎症起主要作用[2]。促炎信号通路及其下游产物正成为糖尿病肾病新的生物标志物和有前景的治疗靶点。研究观察发现，益肾化湿颗粒具有降低糖尿病肾病患者炎性因子的作用，但其具体机制不明确[3]。本课题组前期研究发现在高糖环境下培养的系膜细胞，其炎性因子如白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6等的表达明显增加，其机制与RhoA/Rho相关卷曲螺旋形成的蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil containing protein kinase，ROCK1)信号通路有关，提示RhoA/ ROCK1信号通路参与糖尿病肾病的炎症发病机制[4]。因此，本研究拟探讨益肾化湿颗粒通过RhoA/ROCK1信号通路对糖尿病肾病炎症的影响及可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级雄性SD大鼠60只，10～12周龄，体重(380±20)g；益肾化湿颗粒：成分包含人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜、大枣，规格为10 g/袋，获赠于广州康臣药业有限公司；ELISA试剂盒购自武汉优尔生商贸有限公司；Western blot检测试剂购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1动物模型的制备与分组

60只SD清洁级雄性大鼠适应性喂养2周后分为对照组、糖尿病肾病组和干预组，每组20只。糖尿病肾病组与干预组大鼠采用腹腔注射佐链霉素(60 mg/kg)制备糖尿病肾病模型，注射佐链霉素72 h后检测空腹血糖，若≥16.7 mmol/L为糖尿病模型建立成功。对照组予以普通饲料喂养，糖尿病肾病组与干预组予以高脂高糖喂养，糖尿病肾病造模成功的标准为连续2次空腹血糖≥16.7 mmol/L、24 h尿蛋白排泄率>30 mg，继续喂养至8周后进行下一步的实验。

1.2.2干预方法

采用灌胃给药，干预组予以益肾化湿颗粒(5 g/kg)，按0.2 mL/10 g体重进行灌胃，每天1次；对照组及糖尿病肾病组给予等量0.9%生理盐水进行灌胃；干预期间均采用普通饲料进行喂养，自由饮水，不使用任何降糖治疗，干预时间为4周。

1.2.3标本留取

留取大鼠尾静脉全血测血糖、血肌酐、核因子-κB(nuclear factor Kappa-B,NF-κB)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)；收集24 h尿液测24 h尿蛋白定量(全自动生化分析仪测定)；干预结束后各组SD大鼠处死，无菌留取肾脏，取部分肾组织于10%甲醛固定后进行光镜的观察，其余肾组织采用液氮保存用于Western blot检测。

1.2.4ELISA检测

全血离心，取血清进行NF-κB、IL-6、TNF-α表达水平的检测，按NF-κB、IL-6、TNF-α ELISA检测试剂盒的说明进行操作，获取吸光度(A)值，根据标准曲线计算NF-κB、IL-6、TNF-α表达水平。

1.2.5Western blot检测

从液氮中取部分预留的肾组织，提取总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转入聚偏二氟乙烯(PDVF)膜，5%脱脂牛奶常温下密封2 h。加抗体孵育过夜。取出后使用TBST液进行冲洗，使之结合二抗，60 min后清洗、显色，对RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α相对表达水平进行检测。

1.2.6苏木素-伊红(HE)染色

取SD大鼠肾组织，用4%甲醛浸泡，24 h后常规石蜡包埋并连续切片。脱蜡处理后放入不同浓度的乙醇中各复水3 min，苏木素染色15 min，清洗3次后盐酸乙醇分化处理30 s，1%伊红染色，脱水处理后脱蜡处理，封片后使用显微镜进行观察并拍照。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 动物模型建立前3组大鼠一般情况比较

动物模型建立前，3组大鼠体重、血糖、血肌酐比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 动物模型建立前3组大鼠一般情况比较

2.2 药物干预前3组大鼠一般情况比较

药物干预前，与对照组比较，糖尿病肾病组24 h尿蛋白定量、血肌酐、NF-κB、IL-6、TNF-α水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；干预组与糖尿病肾病组以上指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 药物干预前3组大鼠一般情况比较

2.3 药物干预后3组大鼠一般情况比较

药物干预后，与糖尿病肾病组比较，干预组24 h尿蛋白定量、血肌酐、NF-κB、IL-6、TNF-α水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 药物干预后3组大鼠一般情况比较

2.4 药物干预后3组大鼠肾脏病理变化情况

对照组肾组织的肾小球结构完整，皮、髓质分界清楚，系膜、基质未见明显增生。糖尿病肾病组肾小球体积增大，部分系膜区增宽，系膜细胞数目有增加，可见部分毛细血管管腔变形扩张；肾小管扩张明显，小管细胞肥大，管腔变窄，部分伴有小管上皮细胞空泡样变性，提示糖尿病肾病中晚期的改变。干预组大鼠肾小球系膜增生较糖尿病肾病组略有减轻，见图1。

A：对照组；B：糖尿病肾病组；C：干预组。

2.5 药物干预后3组大鼠肾组织相关蛋白表达情况

与对照组比较，糖尿病肾病组肾组织RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α蛋白相对表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与糖尿病肾病组比较，干预组肾组织RhoA、ROCK1、NF-κB、IL-6、TNF-α蛋白相对表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

a:P<0.05。

3 讨 论

炎症已成为糖尿病肾病的重要病理生理机制，慢性微炎症和免疫系统激活在糖尿病肾病发病机制中具有重要作用。肾组织中NF-κB的活化在糖尿病肾病的发生、发展中起重要作用，NF-κB易位进入细胞核并触发靶基因的表达，导致持续并逐渐增强的炎症表达不断增加，最终导致肾脏纤维连接蛋白的过度表达和细胞外基质的沉积，加剧肾功能的恶化。

Rho蛋白属于Ras蛋白超家族成员之一，是一组分子量为20×103～30×103的GTP结合蛋白，其作用与细胞骨架结构改变相关，与细胞形态、细胞黏附、信号传导、细胞增殖等多种生物学行为也有密切联系。被激活的Rho蛋白的靶效应器是Rho激酶，即ROCK，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是Rho下游靶效应分子中功能研究最为清楚的。ROCK由两种同源性极高的异构体构成，ROCK1和ROCK2，肾组织中高表达ROCK1。阻断糖尿病鼠的RhoA/ROCK通路后可以改善肾小球的通透性[5]和肾脏的血流动力学[6]。多项研究证实糖尿病肾病患者体内的RhoA/ROCK的激活增加，阻断RhoA/ROCK信号通路后可以显示出其肾保护作用[7]，均提示RhoA/ROCK信号通路参与糖尿病肾病进展的过程。

在本课题组前期的研究中发现，NF-κB的活化受RhoA/ROCK信号通路的调控[8]。QIAN等[9]在心肌缺血再灌注损伤的大鼠模型中发现，抑制RhoA/ROCK/NF-κB途径，可以抑制炎性因子的表达，从而对心肌细胞起到保护作用。另有研究表明，抑制RhoA/NF-κB途径，可以抑制晚期糖基化终末产物对糖尿病肾病患者足细胞的损伤，成为糖尿病肾病潜在的治疗新靶点[10]。

益肾化湿颗粒由人参、黄芪、白术、茯苓、泽泻、半夏、羌活、独活、防风、柴胡、黄连、白芍、陈皮、炙甘草、生姜、大枣等药组成，具有增强和调节免疫等药理作用。主要成分黄芪能明显提高其网状内皮细胞的吞噬功能[11]。茯苓能激活腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)，减弱成纤维细胞激活和异常细胞外基质的沉积，降低尿蛋白[12]。刘孝琴等[13]研究发现益肾化湿颗粒可能通过降低早期糖尿病肾病患者高敏C反应蛋白和IL-8的表达，抑制炎性反应，从而对早期糖尿病肾病有一定的保护作用。沈文清等[14]以60例慢性肾脏病2～3期患者为研究对象，治疗组口服益肾化湿颗粒，对照组口服中成药肾衰宁片，观察时间为6个月，治疗组治疗后高敏C反应蛋白、IL-6、TNF-α均较治疗前下降，且差异有统计学意义(P<0.05)；对照组治疗前后高敏C反应蛋白、IL-6、TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示益肾化湿颗粒可改善慢性肾脏病2～3期患者的微炎症状态。

本研究结果发现益肾化湿颗粒干预患有糖尿病肾病的SD大鼠后，SD大鼠的24 h尿蛋白定量有一定程度下降，提示益肾化湿颗粒具有降低尿蛋白的作用，与益肾化湿颗粒治疗糖尿病肾病有效性与安全性meta分析的结果一致[15]。且干预后的SD大鼠血清中NF-κB、IL-6、TNF-α的表达及肾组织中NF-κB、IL-6、TNF-α的表达均有下降，说明出益肾化湿颗粒具有下调炎性因子表达从而发挥肾保护作用。糖尿病肾病组SD大鼠肾组织RhoA、ROCK1、NF-κB蛋白的表达较对照组明显升高，提示在糖尿病肾病的过程过中，RhoA/ROCK1/NF-κB信号通路被激活。予以益肾化湿颗粒干预后，干预组SD大鼠肾组织RhoA、ROCK1、NF-κB蛋白表达下调，推理出益肾化湿颗粒可能通过RhoA/ROCK1/NF-κB信号通路调控下游IL-6、TNF-α等炎性因子的表达，减轻糖尿病肾病的炎症状态，从而达到降低尿蛋白，改善肾功能的作用。目前本研究仅对益肾化湿颗粒的给药剂量5 g/kg进行研究，药物干预时间点为4周，不同的剂量及药物干预时间点的作用有待于进一步的探究。

综上所述，在糖尿病肾病的发生、发展过程中，RhoA/ROCK1/NF-κB信号通路被激活，成为糖尿病肾病防治的新靶点，益肾化湿颗粒能够部分抑制RhoA/ROCK1/NF-κB信号通路，改善糖尿病肾病的炎症状态，具有延缓或逆转糖尿病肾病进展的潜在价值。深入研究益肾化湿颗粒在糖尿病肾病中的机制，有望获得更高的临床应用价值。