袁秀梅 李思瓯 尹昌浩*
（1牡丹江医学院红旗医院神经科，牡丹江157003；2牡丹江医学院红旗医院内分泌科，牡丹江157003）
人参皂甙Rbl对大鼠局灶性脑缺血细胞凋亡的抑制作用※
袁秀梅1李思瓯2尹昌浩1*
（1牡丹江医学院红旗医院神经科，牡丹江157003；2牡丹江医学院红旗医院内分泌科，牡丹江157003）
目的探究人参皂甙Rbl对大鼠局灶性脑缺血细胞凋亡的抑制作用。方法首先建立一个阻塞大鼠大脑局灶性暂时脑缺血的模型，将神经功能出现缺失症的大鼠按照随机的原则分别分为GRb1组与缺血组，然后对灌注后的GRb1组大鼠进行人参皂甙Rbl腹腔注射，以45 mg/kg为宜，对这些大鼠进行不同时间阶段的再灌注，按照时间点的不同，将GRb1组大鼠分为7个组别，然后用免疫组织化学法以及原位末端标记法对大鼠的细胞凋亡情况进行观察分析。结果经过参皂甙Rbl干预的GRb1组大鼠与缺血组相比，其各分组内的大鼠凋亡细胞数量降低，且仅在灌注的12 h～3 d时间阶段内的降低数量差异比较明显，NAIP阳性细胞数在进行再灌注12 h～10 d与缺血组有着明显的差别，Bcl-2阳性细胞数在灌注12 h～10 d期间出现了明显的上升趋势，且与缺血组大鼠相比，Bax阳性细胞数在相同的时间点出现下降。结论采用人参皂甙Rbl能够通过对NAIP与Bcl-2的促进起到对大鼠的局灶性脑缺血细胞凋亡的保护作用，可以在临床医学中得以广泛地推广、应用。
人参皂甙Rbl；大鼠；局灶性脑缺血；细胞凋亡；抑制；动物实验；中风
随着我国社会主义现代化建设的不断发展，我国的医疗卫生水平得到了空前的提升。目前，临床医学中对人参单体的作用进行了深入研究，并取得了卓有成效的研究成果。人参皂甙Rbl能够在一定程度上减少局灶性脑缺血的细胞凋亡，促进脊髓神经元的恢复生长，进而对局灶性脑缺血起到保护作用。为了探究人参皂甙Rbl对大鼠局灶性脑缺血细胞凋亡的抑制作用，特建立阻塞大鼠大脑局灶性暂时脑缺血的模型，并进行深入研究，现对此做一个汇报：
1 资料与方法
1.1 一般资料首先随机选取雌雄不均的成年Wistar大鼠，体质量在240 g～300 g之间，实验中所用到的人参皂甙Rbl经医学奠定纯度在98%以上，单克隆小鼠抗Bax、Bcl-2，生物素化羊抗小鼠抗体及辣根酶标记链霉卵白素由北京生物试剂公司提供，单克隆小鼠抗神经元凋亡抑制蛋白由Santa Cruz公司提供，对细胞凋亡检测的试剂盒则是从武汉博士德公司购进［1］。
1.2 研究方法首先要建立一个局灶性脑缺血模型，可以按照线栓法对其进行详细制作，采用1%的戊巴比妥钠腹腔对大鼠进行注射麻醉，然后在无菌的环境下，对大鼠的颈部腹侧行一切口，使这个切口充分暴露，对大鼠的右侧颈总动脉、颈内外动脉进行分离，对直径0.2 mm左右的尼龙线进行尖端烧圆并沿着颈外动脉分叉处插入距离在1.8 cm左右，大致到大鼠的颈内动脉出现大脑中动脉的地方，阻塞持续2 h左右，然后用乙醚将大鼠麻醉，再将尼龙线推出至颈内动脉颈部，进而实现再次灌注［2］。然后将具有神经功能缺失症的大鼠按照随机的原则分为人参皂甙Rbl组与缺血组，在对Rbl组进行再灌注时需向其注射40 mg/kg的人参皂甙，而对于假手术组的大鼠，由于尼龙线长度不够，难以达到颈内动脉的大脑动脉处，这4只大鼠未出现神经缺失症状，可将其作为正常对照组，对实验组大鼠在进行再灌注后3 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、10 d这些时间点，以每个时间点4只对其进行麻醉处死，而对照组大鼠则在手术后的2 d进行处死，大鼠的脑组织采用4%多聚甲醛以及生理盐水进行心脏灌注固定，用石蜡包埋，切片呈现5 um厚度的冠状［3］。
1.3 免疫组织化学首先对切片进行脱蜡处理，抗原经复合消化液（Bax）、0.1%胰酶（NAIP）和0.01 mol/L柠檬酸缓冲液热修复（Bcl-2）处理；将10%山羊血清在室环境下温孵育20 min左右，单克隆抗体Bcl-2、bax和NAIP（1∶100），在37℃温度下孵育60 min，生物素化羊抗小鼠二抗，37℃，30 min；HRP-Streptavidin，37℃室温下孵育30 min。上述各项步骤结束后，采用0.01 mol/L的磷酸缓冲液反复冲洗，以3～5次为宜，孵育在湿盒内进行。DAB显色3～5 min，苏木素轻度复染。阴性对照除不加一抗外，其余处理相同。
1.4 细胞凋亡分析对大鼠脑缺血细胞凋亡的检测试剂盒来确定DNA链断裂的的细胞数量。首先，采用蛋白酶K消化以及2%的过氧化氢溶液对脱蜡切片的内源性过氧化物酶活性进行抑制［4］，然后通过末端脱氧核糖核酸转移酶以及生物素化抗地高新抗体对切片进行处理，采用阴性对照则用水代替TdT，然后用苏木素对细胞核进行轻度复染。
1.4 图片分析与统计学处理选取每只大鼠4张左右的前囱后1.9～2.9 mm冠状切面切片进行观察分析，主要对大鼠的缺血侧皮质、纹状体以及视前区进行观察，并准确记录大鼠免疫反应阳性细胞数以及凋亡的细胞数量［5］，Rbl组与缺血组的同时间点采用t进行检验，Rbl组内部的不同时间点的比较用方差进行分析，所采用的计量数据用X列卡方来进行检验，当P＜0.05时，有统计学意义。
2 结果
经过实验分析，假手术组与正常组大鼠脑实质内可以看出0～3个的细胞凋亡（如图1），对大鼠进行脑缺血再灌注，3 h后凋亡的细胞数量开始出现上升，到了24 h后，达到了一个巅峰，然后逐渐出现下降趋势，到了10 d时，其细胞凋亡指标与对照组相比仍有明显的差异（P＜0.05），大鼠的凋亡细胞主要集中分布在视前区、额顶皮质以及纹状体（如图2），并且细胞凋亡大部分都出现在梗死灶边缘位置。另外，细胞凋亡主要是以神经元为主，除此之外还包含了血管内皮细胞、脉络丛上皮细胞等。通过对GRb1组的分析，可以发现其与缺血组相比，在再灌注的12 h时，细胞凋亡开始出现了明显的下降趋势，该现象持续到3 d（P＜0.05）（如图3），在再灌注5 d～10 d期间，GRb1组与缺血组没有明显的差异，无统计学意义（如图4）。
图1 假手术组与正常组大鼠细胞凋亡情况
图2 大鼠凋亡细胞分布图
图3 再灌注12h细胞凋亡情况
图4 再灌注5～10 d细胞凋亡情况
3 讨论
目前，临床医学中对缺血性神经元损伤进行深入的研究，并取得了一定的研究成果。细胞的凋亡与坏死是并存的，通过本次研究，可以发现局灶性脑缺血会引起大量细胞凋亡现象，研究结果与以往相比，有着一致性，该实验结果显示，GRb1组通过大脑中动脉阻塞后施以GRb1能够有效抑制由于脑缺血导致的神经元凋亡，尽管对GRb1抑制细胞凋亡的机制仍是模糊的，但可以得知缺血性神经元损伤主要包括的病理有谷氨酸兴奋性毒性、自由基以及基因表达的改变［6］。而GRb1具有清除自由基的功效，并能够有效抑制钙物质的过量流入，对神经元起到一定的保护作用。对大鼠进行GRb1注射，然后实行再灌注，在12 h后就能够使bcl-2的阳性细胞数明显升高，而bax阳性细胞却开始出现下降，这在一定程度上是抗凋亡机制的表现。该研究结果与国内学者报道缺血预处理促进bcl-2表达和抑制bax表达的研究结果相似，说明Bcl-2蛋白表达能够增加而Bax蛋白则呈现下降，是抗凋亡的一种机制。此外，聂荣庆等学者在研究报道中将原代培养的大鼠皮质神经元中加入Rb1，可以发现其能够降低由于低氧所致的神经元的凋亡率，增加bcl-2蛋白、降低bax蛋白的表达。因此，在体和离体实验均证实Rb1通过上调bcl-2蛋白和下调bax蛋白表达，提高bcl-2与bax的比率抑制细胞凋亡，从而在大鼠的实验性卒中中发挥神经保护作用。目前有研究表明人参皂苷Rb1能促进周围神经轴突生长，但其在中枢神经系统中轴突的作用尚未有研究。本实验在MCAO/R 3 d后，模型组胼胝体APP蛋白表达增多并出现聚集，在内囊也有聚集。而经GSRb1干预的大鼠APP蛋白表达降低，表明人参皂苷Rb1可能促进中枢神经轴突重塑。本次研究中建立了大鼠脑缺血模型，在灌注3 h后，NAIP阳性细胞呈现出上升趋势，2 d后达到顶峰，后逐渐下降，其作为一种内源性凋亡抑制物，能够使caspase-3以及caspase-7失活，同时对细胞凋亡起到阻碍作用，进而使GRb1出现上调，阻止神经元凋亡。通过本次研究，可以发现GRb1对神经元具有一定的保护作用，能够抑制大鼠脑缺血凋亡细胞的降低，可能在中枢神经系统损伤后康复中起促进作用。具有一定的应用价值，符合胶质细胞比神经元更能经受缺血性损伤的理论，其作用机制与上调NAIP和Bcl-2蛋白和降低Bax蛋白表达有关。临床医学可以对此进行深入研究，在医学事业中得以应用发展。
［1］胡光强，张慧，萧洪文，等.人参皂苷Rbl对大鼠局灶性脑缺血白质重塑的影响［J］.中国临床解剖学杂志，2015（4）：451-454.
［2］李亮，何军锋，蔡雄，等.人参皂苷Rg1对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经保护作用的实验研究［C］//第十二次全国中西医结合实验医学专业委员会暨第七次湖南省中西医结合神经科专业委员会学术年会论文集. 2015.
［3］王巧云，刘凤，吴峰阶，等.人参皂苷Rg1对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠海马p-ERK1/2与p-JNK表达的影响［J］.中国中西医结合杂志，2013，33（2）：229-234.
［4］游咏梅，薛偕华.电针足三里穴、曲池穴对脑缺血再灌注大鼠Bad及其磷酸化的影响［J］.亚太传统医药，2014，10（4）：21-23.
［5］江欣，陈立典.电针曲池、足三里对脑缺血大鼠NICD表达影响观察［J］.亚太传统医药，2014，10（4）：25-26.
［6］Young L Y，Jin-Sun P，Eun-Jung L，et al.Anti-inflammatory Mechanism of GinsengSaponin Metabolite Rh3 in Lipopolysaccharide-Stimulated Microglia：Critical Role of 5'-Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase SignalingPathway.［J］.Journal ofAgricultural&Food Chemistry，2015，63（13）.
Inhibition of Ginsenosides Rbl on Focal Cerebral Ischemia and Apoptosis
YUAN Xiumei1，Li Siou2，YIN Changhao1*
（1.Department of Neurology，Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Helongjiang Province，Mudanjiang 157003，China；2.Department of Endocrinology，Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Helongjiang Province，Mudanjiang 157003，China）
Objective To explore the inhibition of ginsenosides Rbl on focal cerebral ischemia and apoptosis.Methods Firstly，a cerebral occlusion model of focal cerebral ischemia in temporarily was established.The neurological deficit disorder occurs in rats in accordance with the principle of random were divided into GRb1 group and ischemia group.After perfusion，the GRb1 group with large ginsenosides Rbl mice was injected intraperitoneally with 45mg/kg.These rats were given reperfusion in different period of time，according to different points in time，and the rats were divided into seven groups GRb1 groups.The immunohistochemistry TUNEL method was used to observe and analyze cell apoptosis of rats.Results After the intervention of ginsenoside Rbl GRb1 rats with ischemia group compared to the number of apoptotic cells in rats which each packet was lowered，and only reduce the number of differences in perfusion 12h～3d period of time within the more obvious，NAIP positive cells during reperfusion 12h～10d and ischemic group has a significant difference，Bcl-2 positive cells in perfusion has a clear upward trend during the 12h～10d，and compared with ischemic rats，Bax positive cells decline at the same point in time.Conclusion Ginsenoside Rbl through NAIP and promoting Bcl-2 plays a protective effect on focal cerebral ischemia in rat's apoptosis，and can be widely promotion and application in clinical medicine.
ginsenoside Rbl；rats；focal cerebral ischemia；apoptosis；inhibition；animal experiment；stroke
10.3969/j.issn.1672-2779.2016.20.063
1672-2779（2016）-20-0138-03
杨杰 本文校对：尹昌浩
2016-06-21）
牡丹江医学院科研项目资助（No：2010-06）
*通讯作者：yinchanghao7916@sina.com
