徐晶晶，饶沁玲，鲍红娟，马启文，徐紫嫚，向云亚

（1.厦门医学院药学系，福建 厦门 361023；2.厦门医学院呼吸疾病研究所，福建 厦门 361023）

咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）是一种以慢性、顽固性咳嗽为主要或唯一临床表现的特殊类型的哮喘，是引起成人及儿童慢性咳嗽的首位病因，约占1/3[1-2]。目前国内外治疗CVA的药物主要包括吸入性糖皮质激素（ICS）、支气管扩张剂、白三烯受体拮抗剂等，但禁忌证、副作用和药物成瘾性导致临床疗效普遍不佳[3-4]。中医药历代治咳、治哮喘的经验可为辨治CVA提供宝贵的借鉴。现代临床上麻杏石甘汤常被单独或与其他药物联合使用，它治疗CVA、支气管哮喘、过敏性咳嗽、肺炎、上呼吸道感染等呼吸系统疾病，有着确切的疗效。

麻杏石甘汤出自《伤寒论》，由麻黄、杏仁、石膏和炙甘草4味药组成，具有辛凉宣肺、清热平喘之功效，主治肺热咳喘证。近年来，临床发现麻杏石甘汤治疗CVA疗效显着，麻杏石甘汤在临床上单独使用或配伍其他药物治疗CVA均有明显效果[5-6]。现代研究发现，慢性咳嗽及哮喘等呼吸道疾病的发生与呼吸道内TRPV1的表达异常及其介导的信号传递异常密切相关[7-8]。TRPV1通道在呼吸系统的功能调节中发挥着重要作用。本研究基于TRPV1信号转导通路，研究麻杏石甘汤对CVA模型大鼠支气管及肺中TRPV1及NK-1R表达的影响，为进一步探讨其作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物60只SPF级健康雄性Wistar大鼠，体质量140～160 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005。大鼠饲养于恒定的环境中，温度保持在20～24℃，湿度为50%～70%。实验经厦门医学院动物实验伦理委员会审核通过。麻醉处死全部实验大鼠，实验过程中动物处理严格按照国家科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的动物伦理学标准进行。

1.2 药物 麻杏石甘汤（药物组成：麻黄9 g，杏仁9 g，生石膏18 g，炙甘草6 g），饮片购自北京同仁堂（集团）有限责任公司。制备方法如下，麻黄、生石膏先煎，将麻黄、生石膏（布包煎）饮片加8倍药物质量的蒸馏水浸泡30 min后，煎煮15 min，再加入杏仁、炙甘草一起煎煮30 min，纱布粗滤取药液；药渣加6倍药物质量的水，煎煮30 min，纱布粗滤去渣，合并两次药液，旋蒸回收溶剂，浓缩至全方生药量1.4 g/mL，4℃保存备用。吸入用布地奈德混悬液（阿斯利康医药公司，批号：324166）。

1.3 试剂 卵清蛋白（OVA，美国Sigma公司，批号：SLBQ9036V）；天然辣椒碱（阿拉丁试剂上海有限公司，批号：L1807087）；氢氧化铝（阿拉丁试剂上海有限公司，批号：H1813008）；大鼠降钙素基因相关肽（CGRP）ELISA试剂盒（天津安诺瑞康生物技术有限公司，批号：175190711）；大鼠P物质（SP）ELISA试剂盒（天津安诺瑞康生物技术有限公司，批号：534190711）；4%多聚甲醛（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：HP190703）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20190104）；蛋白预染Marker（美国Thermo Fisher公司，批号：00677289）；TRPV1抗体（批号：ab6166）、NK-1R抗体（批号：ab131091）（abcam公司）；HRP标记的山羊抗兔抗体（ABclonal公司，批号：9300014001）；ECL发光检测试剂盒（上海天能科技有限公司，批号：180-5001）。

1.4 主要仪器5417R台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；KZ-Ⅱ高速组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）；Multiskan GO全波长酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；403M超声雾化器（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）；小动物雾化箱（50 cm×40 cm×30 cm）；TX-110X50水浴摇床（上海天呈实验仪器有限公司）；Smart2Pure纯水机（美国Thermo Fisher公司）；N-1200旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；DZF电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；YLS-8A多功能诱咳引喘仪（济南益延科技发展有限公司）；EPS600电泳仪、VE180微型垂直电泳槽、VE186转移电泳槽（上海天能科技有限公司）；ChemiDoc TM XRS+化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.5 造模与分组 将60只健康Wistar大鼠用简单随机分组法分为正常对照组，模型对照组，布地奈德组及麻杏石甘汤高、中、低剂量组，每组10只。除正常对照组外，其余各组大鼠采用OVA和Al（OH）3激发致敏，并用OVA雾化激发来建立CVA大鼠模型[9-11]，大鼠于造模第1、8天腹腔注射1 mL抗原液[含OVA、Al（OH）3各100 mg]致敏。并于15 d后将各组大鼠分别置于小动物雾化箱内，每日上午用含1% OVA的生理盐水溶液超声雾化激发20 min，共15 d，以激发哮喘。当大鼠出现腹肌明显收缩，呼吸加深、加快等呼吸道痉挛症状，提示CVA大鼠造模成功[12]。

1.6 实验给药 于造模第15天开始给药，各给药组大鼠均于OVA雾化激发前30 min给药干预，共治疗15 d。给药组剂量换算以成人临床用药剂量为依据，再根据人与大鼠体表面积换算比进行折算。麻杏石甘汤高、中、低剂量组大鼠分别灌胃给予7、3.5、1.75 g/kg麻杏石甘汤，给药体积1 mL/100 g，布地奈德组大鼠给予布地奈德雾化吸入，0.33 mg/kg。正常对照组和模型对照组大鼠均用的蒸馏水灌胃，1 mL/100 g。

1.7 观察指标

1.7.1 一般体征观察 观察造模后各组大鼠的皮毛、活动、饮食及体质量等一般体征的变化情况，同时观察其咳嗽、喘息等症状变化。

1.7.2 咳嗽次数观察 采用辣椒素激发法比较各组大鼠的气道敏感性[13]。于实验第30天，末次给药后30 min，将大鼠放入诱咳引喘仪的雾化盒内，雾化吸入1×10-4mol/L辣椒素溶液60 s，立即停止刺激，再在盒内停留60 s，记录2 min内各组大鼠的咳嗽次数。

1.7.3 大鼠肺、支气管病理组织形态学观察 大鼠麻醉后处死，迅速取出右肺组织，用冰生理盐水冲洗，滤纸擦干，右肺中叶置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋、切片，HE染色后，镜下观察其支气管、肺组织的病理学改变。

1.7.4 ELISA法检测大鼠肺组织中CGRP、SP的含量 将超低温冰箱中保存的肺组织取出，称取100 mg放入EP管中，加入1 mL冷PBS，用眼科剪将组织快速剪碎后用高速组织研磨仪研磨90 s，4℃下3 000 r/min离心15 min，取上清液严格按照试剂盒说明书测定。

1.7.5 Western blotting检测大鼠气管中TRPV1蛋白及肺组织中NK-1R的表达 将超低温冰箱中保存的各组大鼠气管、肺组织取出，每组选6个样品分别按比例加入预冷的裂解液后，用眼科剪将组织快速剪碎后用高速组织研磨仪研磨90 s，4℃下12 000 r/min离心15 min，收集上清液，加入上样缓冲液后煮沸变性。每孔加样后进行SDS-PAGE电泳，转膜后封闭处理1.5 h，分别加入一抗TRPV1、NK-1R、GAPDH（1∶2 000）孵育过夜，TBST洗涤3次，每次5 min，加入二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST洗涤后，加入适量ECL试剂于化学发光仪成像，采用Image J图像分析软件对图像进行信号分析，计算目的蛋白/GAPDH蛋白比值。

1.8 统计学方法 采用SPSS 25.0软件对数据进行处理，计量资料以（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，以P〈0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 麻杏石甘汤对CVA大鼠一般体征的影响 造模前，各组大鼠行动灵活，反应敏捷，毛色光泽，体质量等情况基本一致。模型对照组、布地奈德组及麻杏石甘汤高、中、低剂量组大鼠在腹腔注射OVA后出现活动减少，拱背蜷缩等表现；在用OVA雾化激发后，模型对照组，布地奈德组及麻杏石甘汤高、中、低剂量组大鼠均出现躁动不安、挠鼻、打喷嚏、呼吸急促等症状，并且可见其皮毛失去光泽，体质量增长缓慢，模型对照组中1只大鼠体质量减轻，在造模期间死亡。经药物治疗后，各给药组大鼠在实验结束时一般状态较模型对照组好。

2.2 各组大鼠咳嗽次数比较 模型对照组大鼠咳嗽次数明显多于正常对照组（P〈0.01）；布地奈德组及麻杏石甘汤高、中、低剂量组大鼠咳嗽次数均明显少于模型对照组（P〈0.01）；麻杏石甘汤中、高剂量组及布地奈德组大鼠咳嗽次数均少于麻杏石甘汤低剂量组（P〈0.01）；麻杏石甘汤中、高剂量组大鼠咳嗽次数与布地奈德组比较，差异均无统计学意义（P〉0.05）。（见表1）

表1 各组大鼠咳嗽次数比较（±s，次）

表1 各组大鼠咳嗽次数比较（±s，次）

注：与正常对照组比较，aP〈0.01；与模型对照组比较，bP〈0.01；与麻杏石甘汤低剂量组比较，cP〈0.01

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）咳嗽次数正常对照组 10 - 2.70±1.06模型对照组 10 - 6.60±1.26a布地奈德组 9 0.33×10-3 3.11±1.05bc麻杏石甘汤低剂量组 10 1.75 5.10±1.37b麻杏石甘汤中剂量组 10 3.50 3.40±1.07bc麻杏石甘汤高剂量组 10 7.00 3.00±1.15bc

2.3 各组大鼠肺、支气管病理组织形态学改变 正常对照组大鼠支气管及肺泡结构正常，支气管管壁及平滑肌厚度正常，支气管上皮细胞完整，肺泡腔内清洁无渗出，未见炎症细胞浸润。模型对照组大鼠支气管管腔狭窄，黏膜增厚，支气管周围血管扩张、充血，肺泡腔增大，肺泡间隔及气道平滑肌明显增厚，可见明显淋巴滤泡及纤维组织增生，有大量的炎症细胞浸润。布地奈德组及麻杏石甘汤高、中、低剂量组大鼠肺及支气管组织病理变化明显减轻，无淋巴滤泡，肺泡间隙稍增厚，炎症细胞浸润较模型对照组减轻。布地奈德组、麻杏石甘汤高剂量组病理改善更明显。（见图1）

图1 各组大鼠肺、支气管组织病理变化（HE，×100）

2.4 各组大鼠肺组织CGRP、SP含量比较 模型对照组大鼠肺组织中神经肽类物质CGRP、SP含量明显高于正常对照组（P〈0.01）；麻杏石甘汤中、高剂量组及布地奈德组大鼠肺组织中CGRP、SP含量明显低于模型对照组（P〈0.01）；麻杏石甘汤中剂量组大鼠肺组织中CGRP含量低于麻杏石甘汤低剂量组（P〈0.05）；麻杏石甘汤中、高剂量组大鼠肺组织中，CGRP、SP含量与布地奈德组比较，差异均无统计学意义（P〉0.05）。（见表1）

表2 各组大鼠肺组织CGRP、SP含量比较（±s，pg/mg）

表2 各组大鼠肺组织CGRP、SP含量比较（±s，pg/mg）

注：与正常对照组比较，aP〈0.01；与模型对照组比较，bP〈0.01；与麻杏石甘汤低剂量组比较，cP〈0.05

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg） CGRP SP正常对照组 10 - 26.16±2.31 19.70±2.08模型对照组 10 - 30.12±2.82a 22.89±1.46a布地奈德组 9 0.33×10-3 26.84±1.98b 19.25±1.80b麻杏石甘汤低剂量组10 1.75 28.68±2.13 21.18±2.11麻杏石甘汤中剂量组10 3.50 25.86±2.36bc 19.25±2.73b麻杏石甘汤高剂量组10 7.00 26.74±2.29b 19.21±3.01b

2.5 各组大鼠气管中TRPV1蛋白及肺组织中NK-1R蛋白表达比较 模型对照组大鼠气管中TRPV1蛋白及肺组织中NK-1R蛋白表达高于正常对照组（P〈0.01）；麻杏石甘汤高剂量组及布地奈德组大鼠气管中TRPV1蛋白及肺组织中NK-1R蛋白表达低于模型对照组（P〈0.05或P〈0.01)；麻杏石甘汤中剂量组大鼠气管中TRPV1蛋白低于模型对照组（P〈0.05)；麻杏石甘汤低、中、高剂量组大鼠气管中TRPV1蛋白及肺组织中NK-1R蛋白表达和布地奈德组比较，差异均无统计学意义（P〉0.05）。（见图2）

图2 各组大鼠气管中TRPV1蛋白及肺组织中NK-1R蛋白表达比较（±s，n=6）

3 讨 论

CVA患者的临床表现为慢性、顽固性咳嗽，易受冷热刺激及烟雾异味的影响而加重病情，是支气管哮喘的一种特殊类型。其病理生理改变与哮喘相似，即有气道高敏感性，且具持续性、慢性气道炎症反应[14-15]。气道高敏感性是引发CVA的重要原因。气道高敏感性与TRPV1的兴奋性增加和表达量多少有着密切联系[16]。CVA病程中气道炎症引起的病理改变可在局部形成一个低pH和中热的环境，诱导TRPV1的表达增加而形成咳嗽高敏感性。另一方面TRPV1的表达增加可诱导释放多种神经肽，加重气道神经源性炎症[17]。

TRPV1受体也称辣椒素受体，几乎表达于整个呼吸系统，从上气道到下气道，直至肺泡，外源性刺激物或内源性炎症因子可直接激活TRPV1或间接影响TRPV1的表达，TRPV1通道被激活后沿神经传导通路可引起咳嗽反射[18-20]。TRPV1通道激活所导致的Ca2+内流可触发外周和中枢神经末梢的神经肽如速激肽（SP）和降钙素基因相关肽（CGRP）的释放。这些神经肽可导致支气管收缩、蛋白分泌、气管黏膜水肿和炎症细胞趋化。其经历了“外源性刺激物→TRPV1活化→感觉神经元Ca2+内流→SP和CGRP释放→NKR（NKR：速激肽受体）分子活化”的信号传递过程[21]。

根据CVA的主要临床表现，有学者认为其属于中医学“咳嗽”范畴，也有学者认为其属于中医学“哮病”范畴，还有学者认为“逆咳”较符合本病的特点[22]。麻杏石甘汤出自《伤寒论》，主治肺热咳喘证。现代临床上麻杏石甘汤常被单独或与其他药物联用，治疗CVA、支气管哮喘、过敏性咳嗽等呼吸系统疾病[23]。目前关于麻杏石甘汤治疗CVA具体机制的研究仍较为局限。本研究初步探讨了麻杏石甘汤对CVA模型大鼠的改善作用及作用机理。

本研究结果显示，在接受OVA激发后，除正常对照组外，其余各组大鼠均出现躁动不安、挠鼻、打喷嚏、呼吸急促等症状；且在接受辣椒素刺激后，与正常对照组比较，模型对照组大鼠咳嗽次数明显增加，结合病理结果均提示CVA模型复制成功。经药物治疗后，布地奈德组及麻杏石甘汤高、中、低剂量组大鼠在实验结束时一般状态较模型对照组好且咳嗽次数明显减少；与模型对照组比较，布地奈德组及麻杏石甘汤高、中、低剂量组大鼠肺及支气管组织病理变化明显减轻，肺组织中CGRP、SP含量明显降低，大鼠气管中TRPV1蛋白及肺组织中NK-1R蛋白表达明显降低。

综上所述，麻杏石甘汤可能是通过抑制TRPV1的表达，从而抑制感觉神经肽的释放，降低气道敏感性及改善气道炎症等途径来发挥对CVA模型大鼠的治疗作用。但麻杏石甘汤是通过何种途径调控TRPV1的分布与表达，尚需进一步的研究。