响应面法优化柞水天麻产地加工工艺*

武 旭，吴亚楠，闫海英，张丽娟

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.空军第九八六医院第五门诊部，陕西 西安 710061；3.潼关县人民医院，陕西 渭南 714300）

天麻（Gastrodiae Rhizoma）为兰科植物天麻Gastrodia elata BI.的干燥块茎，立冬后至次年清明前采挖，洗净蒸透敞开低温干燥。天麻具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络等功效，临床上常用于治疗癫痫抽搐、头痛眩晕、手足不遂、肢体麻木、风湿痹痛、小儿惊风、破伤风等[1]。天麻中含有酚类、甾醇类、有机酸类、多糖类等化合物[2-3]。天麻具有镇静安神、抗抑郁、抗焦虑、抗氧化、抗病毒和抗肿瘤等多种药理学活性[4]。柞水天麻产地加工方法一般进行蒸或煮30 min，直至手捏会发软，对光照看时见到半透明无实心，取出用木板压扁后充分干燥；或新鲜天麻直接切4 mm厚片后烘至半干，压平后充分干燥；云南省尚有天麻冻干片，为新鲜天麻切厚片后冷冻干燥的处理方法。但鲜切天麻片受中药饮片产地鲜切合法性影响，仅部分省份如湖北省开展了鲜切天麻片的炮制规范公示，中华人民共和国卫生健康委员会和国家市场监督管理总局仅将天麻作为药食同源试点品种，还尚未纳入药食同源目录进行管理。此类鲜切片多作为保健食品，其药品属性还需结合各省的法规规定。蒸煮的目的即起到“杀酶保苷”的作用，同时便于块茎类药材迅速干燥不至霉变[5-6]。天麻为异养型的药用植物，它的种植栽培在农业和医药业发展中起着重要的作用，不同的产地加工和干燥方法都会影响药材的质量。笔者采用响应面法优化柞水天麻的干燥工艺，以天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E、总多糖和浸出物含量为考察指标，优化天麻药材产地加工工艺，为发展天麻产业，以期保证药源提供可靠方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-2030 Plus岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司，配置LC-2030 UV检测器）；NewCLassic MS-S电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；XM-P102H无极调功超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；0.22 μm微孔滤膜（天津杉羽科技有限公司）；HH-2电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；101型电热鼓风干燥机（上海科恒实业发展有限公司）；L5型紫外-可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）；UPL-10L超纯水机（四川卓越水处理有限公司）。

1.2 试药 天麻素（批号：T10M9F55562，纯度≥98.0%）、对羟基苯甲醇（批号：H21D6Q7813，纯度≥98.0%）均购自上海源叶生物科技有限公司；巴利森苷A（批号：PS011129，纯度≥98.0%）、巴利森苷B（批号：PS011138，纯度≥98.0%）、巴利森苷C（批号：PS011140，纯度≥99.0%）、巴利森苷E（批号：PS012053，纯度≥99.0%）均购自成都普思生物科技股份有限公司。乙腈为色谱纯，无水乙醇、苯酚、硫酸等其他试剂均为分析纯。新鲜天麻药材由柞水县世纪生态农业有限公司提供，经陕西中医药大学药学院王昌利教授鉴定为兰科植物天麻Gastrodia elata BI.的干燥块茎。

2 方法与结果

2.1 天麻药材的加工 2020年版《中华人民共和国药典》规定将新鲜天麻净制后，蒸制透心低温干燥即得。柞水产地通常将天麻蒸透后用木板压扁，白天日晒，夜晚炕烘一周即可。也有文献报道将天麻药材置于55 ℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥，至药材含水量在15%以下（期间取出发汗2次）[7]。综合考虑暂定新鲜天麻产地加工工艺为蒸透后55 ℃干燥5 d。

2.2 天麻药材含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性条件 色谱柱为Agilent5 TC-（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相；按照0～10 min，3%A～10%A；10～15 min，10%A～12%A；15～25 min，12%A～18%A；25～40 min，18%A；40～42 min，18%A～95%A，梯度洗脱。流速：0.8 mL/min，检测波长：220 nm，柱温：40 ℃，进样量：10 μL。理论塔板数按照各个目标峰计算应不低于7 000，分离度不得低于1.6。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取各对照品，用甲醇:水（3∶97）溶液配制成含对羟基苯甲醇（0.079 mg/mL）、天麻素（1.560 mg/mL）、巴利森苷A（0.412 mg/mL）、巴利森苷B（0.347mg/mL）、巴利森苷C（0.371mg/mL）、巴利森苷E（0.145mg/mL）的混合对照品溶液。色谱图见图1A。

2.2.3 供试品溶液的制备 取供试品粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，振摇2 h后称定质量，加热回流3 h，放冷称定，用乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液10 mL，蒸干，残渣用甲醇-水（3∶97）溶解，定容至25 mL量瓶中，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得，色谱图见图1B。

图1 HPLC 色谱图

2.2.4 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下的混合对照品溶液2、8、12、16、20、24 μL，按照“2.2.1”项下的色谱条件进行测定，以进样浓度（mg/mL）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），分别绘制标准曲线。各对照品的线性关系考察结果见表1，可知各成分在线性范围内均呈现出良好的线性关系。

表1 天麻混合对照品标准曲线

2.2.5 精密度试验 将混合对照品溶液重复进样6次，记录各成分对应波长下的峰面积和保留时间。天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E混标的RSD值分别为0.13%、0.12%、0.32%、0.63%、0.41%、0.21%，表明仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 同一天麻药材样品分别在0、2、4、6、8、10、12 h进样，记录峰面积。测得天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E含量的RSD值分别为1.24%、1.41%、1.03%、1.22%、1.47%、2.01%，表明该方法12 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取6份天麻药材照“2.2.3”项下方法制备样品，按照“2.2.1”项下上述色谱条件，测定峰面积并计算含量。结果天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E含量的RSD值分别为1.27%、1.35%、1.43%、1.72%、1.57%、2.33%，表明该方法的重复性较好。

2.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的1 g天麻药材6份加适量天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E对照品，照“2.2.3”项下方法制备样品，进样，记录峰面积。天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E的平均回收率和RSD值见表2，结果表明该方法回收率良好。

表2 加样回收率试验结果（n=6）

2.3 天麻总多糖含量的测定

2.3.1 葡萄糖对照品溶液的制备 精密称取恒重后的无水葡萄糖对照品5.015 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得50.15 mg/mL的葡萄糖对照品溶液[8]。

2.3.2 供试品溶液的制备 称取供试品粉末约0.5 g，精密称定，加95%乙醇100 mL回流提取1 h，趁热过滤，残渣用95%乙醇洗涤3次，每次10 mL，将残渣及滤纸加蒸馏水100 mL，回流提取2 h，趁热过滤，用热水将残渣及提取容器洗涤3次，每次10 mL，洗液与滤液合并，移入250 mL容量瓶中，稀释至刻度，即得[9]。

2.3.3 线性关系考察 精密量取对照品溶液0、20、40、60、80、100 μL，分别置于10 mL试管中，分别加入蒸馏水使其总体积达到1.0 mL，摇匀，分别加入5%苯酚溶液1.5 mL，摇匀，迅速滴入浓硫酸5.0 mL，摇匀。静置10 min，水浴加热15 min，取出放冷，以0 μL的溶液作为空白对照，用苯酚-硫酸法在490 nm波长下检测样品吸光度值。以吸光度为纵坐标，质量浓度为纵坐标绘制标准曲线。葡萄糖线性回归方程为A=1.830 9C+0.032 4，R2＝0.992 6，说明葡萄糖质量浓度在0～0.668 6 mg/mL范围内与紫外吸光度值呈良好的线性关系。

2.3.4 精密度试验 将葡萄糖对照品溶液重复进样6次，记录吸光度，经计算RSD值为1.8%，表明仪器有良好的精密度。

2.3.5 稳定性试验 同一天麻药材样品分别在0、2、4、6、8 h测的吸光度，经计算RSD值为1.0%，结果表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.3.6 重复性试验 取6份天麻药材照“2.3.2”项下方法制备样品进样测得吸光度，计算RSD值为2.60%，表明实验方法有良好的重复性。

2.3.7 加样回收率试验 精密称取6份已知含量的天麻药供试品溶液0.5 mL，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL葡萄糖对照品，照“2.3.2”项下方法制备样品进样计算平均加样回收率及RSD值。天麻药材总多糖的平均回收率和RSD值见表3，结果表明该方法加样回收率良好。

表3 加样回收率试验结果（n=6）

2.4 醇溶性浸出物的测定 参照2020年版《中华人民共和国药典》四部醇溶性浸出物测定法（通则2201)项下的冷浸法[9]测定。

2.5 单因素试验

2.5.1 蒸制时间考察 称取新鲜天麻药材常压蒸制，于蒸锅圆汽后分别在10、20、30、40、50、60 min时间节点取天麻药材。结合对光照看透心和切开看透心的方法判断是否蒸透。天麻鲜药材蒸制20 min时中心仍有硬心，30 min即可达到透心的结果，因此确定30 min为新鲜天麻蒸制透心时间。

2.5.2 干燥温度考察 称取新鲜天麻药材5份，常压蒸制30 min，分别在35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃条件下干燥5 d，测定各样品中天麻素等6种成分，醇溶性浸出物和总多糖的含量，计算总评归一值[根据，总评归一值OD=（d1+d2+d3…+dk）/k，其中Ymin为指标中最小值，Ymax为指标中最大值，k为指标数][10]，同时根据水分测定结果选择合适的干燥温度。实验结果表明，天麻干燥温度过高导致有效成分剧烈降低，也符合药典规定的低温干燥的要求，结合水分测定结果可知35 ℃时天麻药材干燥5 d未达到《中华人民共和国药典》规定水分要求（17.6），55 ℃时水分达标且含量测定OD值也最优，后续以45℃、55 ℃和65 ℃进一步考察最佳干燥温度。

2.5.3 干燥时间考察 称取新鲜天麻5份，常压蒸制30 min，在55 ℃条件下干燥3、4、5、6、7 d。测定各样品中天麻素等6种成分，醇溶性浸出物和总多糖的含量，计算OD值，同时根据水分测定结果选择合适的干燥温度。实验结果表明蒸透心天麻55 ℃干燥4 d后水分即可达标，干燥时间越长含量越高，在第6天的时候基本稳定，后续以5、6、7 d进一步考察最佳干燥温度。

图2 干燥温度及干燥时间的单因素考察结果图

2.6 响应面法优化天麻加工工艺 采用Design-Expert 11软件设计中心复合法试验，结合单因素实验结果，选取天麻干燥温度（A）和干燥时间（B）作为2个考察因素，每个因素3个水平，见表4。以天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E、总多糖和醇溶性浸出物含量总评归一值（OD值）为评价指标，而对实验中选取的2个因素进行考察和优化。

表4 中心设计响应面法因素水平表

对中心设计实验结果运用Design-Expert软件进行响应面分析，结果见表5～6，以天麻含量总评OD值为响应值，对干燥温度和干燥时间多元线性回归二项式方程拟合，拟合的方程模型：OD=0.915-0.2A-0.003 8B-0.589 04A2-0.168 0B2，拟合得到的回归方程P＜0.01，差异有统计学意义。干燥时间和干燥温度对OD值的影响显着（P＜0.05）。实验模型较为显着（P＜0.01），决定系数R2=0.979 1体现出该模型与实验数据拟合程度较高，可应用于天麻含量总评值的预测。OD值与干燥温度和干燥时间的三维效应面曲线见图3。以OD值最大值为目标，根据Design Expert 12实验设计软件得最佳天麻加工最优工艺参数为干燥温度为47.77 ℃，干燥时间为7 d，天麻药材含量预测最大值为0.975。

图3 干燥温度及干燥时间的交互作用响应面图

表5 响应面实验设计结果

表6 方差分析表

2.7 天麻产地加工工艺验证 由Expert-design 11.0软件CCD试验设计，预测到天麻最佳干燥工艺为蒸制30 min透心后，在47.77 ℃下干燥7 d。结合实际操作情况，将天麻的干燥温度确定为50 ℃。该条件下制备3批天麻药材，测定结果见表7，平均OD值为0.979 8，接近且优于预测OD值0.975，证明回归模型预测准确可靠，所优化出的天麻产地加工工艺具有较好的重复性和操作性。

表7 实验验证结果（n=3）

图4 天麻药材图

3 讨论

天麻为常用的名贵中药之一，始载于《神农本草经》，天麻在《神农本草经》中被列为上品，且《本草纲目》《开宝本草》等诸多中医药古籍中均有天麻的记载。天麻素为其主要的有效成分，具有良好的镇痛作用，临床上多用于治疗头痛、眩晕、神经痛、冠心病、心绞痛等[8-9]。在现代应用中为了防止天麻素的分解和酚类成分酶促反应，天麻在干燥之前必须进行“断生”以达到“杀酶保苷”的作用，但天麻素和自身的多糖等成分极易溶于水，故在天麻炮制加工过程中往往采用蒸制法而非煮制。

2020年版《中华人民共和国药典》以天麻素，对羟基苯甲醇，巴利森苷A、B、C、E 6种成分的色谱图，作为特征图谱。同时，巴利森苷A、B、C、E在药材及饮片中含量较高，是天麻中主要的入血成分[11-12]。故本实验以6种特征成分和总多糖及醇溶性浸出物含量作为考察指标，结合响应面法设计实验对天麻药材的干燥工艺进行优化。响应面设计能够对实验中的每个水平进行连续分析从而得到直观的结果[13-14]。本实验以天麻的蒸制时间、干燥温度、干燥时间作为3个考察因素，并以各个考察指标的OD值进行评价。其中干燥温度对天麻品质影响较大，高温干燥处理会导致天麻素类成分急剧下降，因此天麻在加工时应尽量保持较低温度，又要考虑干燥效率避免霉变。笔者应用响应面法分析优选出天麻药材的最佳干燥工艺为蒸制时间30 min，干燥温度50 ℃，干燥时间7 d，为天麻药材的干燥加工提供了可靠依据。