孔鑫磊，黄红英，逯艳艳

（1.青海省中医院，青海 西宁 810016；2.青海省人民医院，青海 西宁 810000）

生化丸由当归、川芎、桃仁、干姜炭和甘草5味中药组成，用于产后受寒恶露不行或行而不畅，夹有血块，小腹冷痛。正常产产妇及剖宫产产妇产后服用小剂量生化丸可促进子宫复原[1-3]。生化丸（大蜜丸）以蜂蜜为黏合剂，约占总量50%，因此蜂蜜的质量对药物的疗效有重要作用[4-5]。蜂蜜的基本组成是以葡萄糖和果糖为主的各种糖类，国家蜂蜜标准（GB 14963—2011）规定蜂蜜中果糖和葡萄糖含量（总量）不少于60 g/100 g，但由于蜂蜜产量有限，市场需求却日益庞大，导致近几年来蜂蜜价格一路攀升，市场较为混乱，掺伪情况时有发生，主要替代品有麦芽糖浆、转化糖浆、果葡糖浆等[6-9]。为考察生化丸整体质量，检测蜂蜜原料在生化丸中的使用情况，笔者建立HPLC-ELSD法测定果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖在生化丸中的含量，以期为生化丸辅料中蜂蜜质量情况提供依据[10-11]。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器BSA224S-CW型万分之一电子天平（德国Sartrious公司）；CP225D型十万分之一电子天平（赛多利斯公司）；Agilent 1260高效液相色谱仪（配备ELSD检测器）（美国安捷伦科技有限公司）；Prevail Carbohydrate ES 5u色谱柱（Grace品牌，型号：5126533.s2546）；PWUV超纯水系统（香港力康发展有限公司）。

1.2 材料果糖对照品（批号：100231-201606）、D-无水葡萄糖对照品（批号：110833-201506）、蔗糖对照品（批号：11507-201303）均购自中国食品药品检定研究院；麦芽糖对照品（批号：150225）购自北京世纪奥科生物技术有限公司；炼蜜由青海省中医院制剂中心提供；当归（市售，批号：20211704）、川芎（市售，批号：20081703）、甘草（市售，批号：20121702）、干姜炭（市售，批号：20121703）、桃仁（市售，批号：20171706）均购自安徽亳州康美中药城，经青海省中医院药剂科黄红英主任药师鉴定，符合2015年版《中华人民共和国药典》一部标准要求；乙腈为色谱纯（德国默克公司）；其他试剂均为分析纯，购自西陇化工；水为超纯水为PWUV超纯水系统制备。

2 方法与结果

2.1 色谱条件Prevail Carbohydrate ES 5u色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（77∶23）；流速：1.0 mL/min；检测器：蒸发光检测器（ELSD）；漂移管温度：75℃；柱温：25℃；进样量：5 μL；记录时间：25 min，各峰分离度〉1.5，理论板数按果糖色谱峰计算大于3 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取果糖对照品0.021 21 g，D-无水葡萄糖对照品0.021 97 g，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL含果糖2.114 mg，葡萄糖2.194 mg）；精密称取蔗糖对照品0.010 53 g，麦芽糖对照品0.010 30 g，置10 mL量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL含蔗糖1.050 mg，葡萄糖1.029 mg）。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，剪碎，取约2 g，精密称定，精密加水50 mL，称定质量，振摇溶散，超声30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性及阳性溶液的制备 模拟制剂阳性溶液：取模拟制剂适量，剪碎，取约2 g，精密称定，精密加水50 mL，称定质量，振摇溶散，超声30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

蜂蜜阴性溶液：取蜂蜜阴性制剂约2 g，精密称定，精密加水50 mL，称定质量，振摇溶散，超声30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 各药材、炼蜜溶液的制备 生化丸溶液：取生化丸处方中各味药材细粉约1 g，精密称定，精密加水50 mL，称定质量，超声30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

炼蜜溶液：取炼蜜约1 g，精密称定，精密加水100 mL，称定质量，振摇溶散，超声30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验按“2.1”色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、模拟制剂阳性溶液、蜂蜜阴性溶液、生化丸溶液等各5 μL，注入高效液相色谱仪，测定，对照品色谱、供试品和缺蜂蜜阴性对照品色谱图见图1。蜂蜜阴性溶液上述条件下显示与蔗糖相同保留时间相同的色谱峰，对生化丸方中各味药材进行4种糖含量的测定，发现其中当归（每1 g含蔗糖762.30 mg）、川芎（每1 g含蔗糖95.07 mg）、甘草（每1 g含蔗糖189.31 mg）中蔗糖含量较大，桃仁中也含少量蔗糖，表明此方法不适合判断生化丸中蔗糖的含量，其他三组分阴性无干扰。

图1 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖HPLC色谱图

2.4 线性关系考察分别精密吸取果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖混合对照品溶液（质量浓度分别为2.114、2.194、1.050、1.029 mg/mL）1、2、5、10、12、15、20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，4种糖对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线。果糖、葡萄糖、蔗糖及麦芽糖分别在1.653～76.259、3.398～152.470、1.927～103.624、1.936～102.583 μg范围内与色谱峰面积呈良好线性关系。回归方程见表1。

表1 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖线性关系考察

2.5 精密度试验精密配置果糖（质量浓度为2.114 mg/mL）和葡萄糖（质量浓度为2.194 mg/mL）的混合对照品溶液；麦芽糖（质量浓度为1.029 mg/mL）对照品溶液，照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，结果果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖峰面积的RSD分别为0.12%、0.10%、0.31%、0.22%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验取“2.2”项下供试品溶液（批号：2151109）适量，分别于室温下放置0、2、6、12、18、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖峰面积的RSD分别为0.51%、1.23%、1.77%、1.98%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验取供试品（批号：2151109）适量，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定并计算各组分含量。结果果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖峰面积的RSD分别为1.51%、1.01%、0.67%、0.88%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验称取已知含量的生化丸（检品号：201700421）适量，剪碎，取约1 g，共6份，精密称定后置于锥形瓶中，精密加入果糖、葡萄糖混合对照品溶液（每1 mL含果糖42.25 mg，葡萄糖22.83 mg）10 mL；蔗糖、麦芽糖混合对照品溶液（每1 mL含蔗糖0.282 2 mg，葡萄糖0.015 7 mg）10 mL，加水80 mL，称定质量，振摇溶散，超声30 min，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。按“2.1”色谱条件测定4种糖含量，计算回收率，4种成分平均加样回收率≥95%，RSD均小于2.0%（n=6），回收率较好，表明方法可行，结果见表2。

表2 4种成分加样回收率试验结果

2.9 样品测定取市售91批生化丸样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件测定，计算样品含量，结果见表3。

表3 生化丸（大蜜丸与小蜜丸）糖含量测定值

续表3：

3 讨 论

国家蜂蜜标准(GB 14963—2011）中规定，蜂蜜中果糖和葡萄糖含量（总量）不少于600 mg/g，2020年版《中华人民共和国药典》“蜂蜜”项下要求蜂蜜中果糖与葡萄糖含量比值不得小于1.0，含果糖和葡萄糖的总量不少于60.0%，蔗糖和麦芽糖含量分别不得过5.0%。生化丸处方中各药材均含有一定量蔗糖，本试验不再考察蔗糖含量占比[12-14]。

按生化丸中蜂蜜与药粉比例折算，企业J、K、L、M生产的生化丸部分批次麦芽糖含量高于《中华人民共和国药典》蜂蜜中麦芽糖含量不得过5.0%的限度，大部分企业生产的生化丸中果糖与葡萄糖总量较低，果糖与葡萄糖含量比值均低于1.0，提示这些企业对蜂蜜辅料的质量不够重视，有意无意掺加或使用了麦芽糖浆[15-17]。

蜂蜜作为蜜丸重要的辅料，《本草纲目》曰：“蜂蜜入药之功有五：清热也，补中也，解毒也，润燥也，止痛也。生则性凉，故能清热；熟则性温，故能补中，甘而和平，故能解毒；柔而濡泽，故能润燥；缓可以去急，故能止心腹肌肉疮疡之痛；和可以致中，故能调和百药而与甘草同功。”足见蜂蜜入药的重要意义[18-21]，因此建议严格监管蜂蜜的投料，完善蜂蜜质量内控指标，从而增加经典中成药的有效性。