★ 朱思洵 黄子慧* 何玲 程兆炎 钱佳燕 夏庆鹏 胡钰慧（.南京中医药大学附属南京市中西医结合医院 南京 004；.中国药科大学 南京 0009）
复方五凤草液［1］为外用中药，系我院名老中医经验方，主要用于结核性溃疡的治疗，疗效确切，前期研究表明其能有效促进结核性溃疡创面表皮生长因子VEGF、FGF-2 的表达［2］。同时临床发现，复方五凤草液对其他慢性创面也有一定的疗效。本次实验通过构建几种常见的慢性创面大鼠模型，对复方五凤草液的干预作用进行药效学初筛，为进一步的药效与机制研究打下基础，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 SD 大鼠，180～200g，雌雄各半，由南京市江宁区青龙山动物养殖场提供，合格证号：SCXK（苏）2017-0001。饲养条件：清洁级，（22±1）℃室温下通风单笼饲养，昼夜自然照明，自由饮水摄食。
1.1.2 试药 复方五凤草液（南京市中西医结合医院制剂室提供，属院内制剂）；复方黄柏液（山东汉方制药）；康复新（湖南科伦制药）；冻疮膏（湖北科田制药）。
复方五凤草液处方：五凤草2kg，白芨240g，猫爪草400g 等。制备工艺：将以上诸药，加水浸过药面，煎煮3 次，每次1h，合并煎液，滤过，滤液浓缩分装，生药含量为2.64g/mL。以上药液由南京市中西医结合医院中药制剂室提供，4℃冰箱保存。
1.2 方法
1.2.1 造模及分组
1.2.1.1 下肢静脉性溃疡动物模型［3］大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉后，剪去左侧大腿根部毛发，仰卧位固定。常规无菌消毒，铺好无菌孔巾。在左侧腹股沟内侧做长约2cm 切口，分离皮下组织和浅筋膜等，分离并暴露髂-股静脉约1.0cm。在其近、远心端用动脉夹夹闭此静脉，然后用自制无齿的12 号蚊式钳夹闭血管，于动脉夹位置相邻，力量为血管钳紧1 扣，时间持续2～3s。松开蚊式钳并进行缝合，局部皮肤常规消毒。手术后24 h，将放置血管夹取出。下肢深静脉血栓模型制备成功3d 后，在无菌操作台上，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，剪去左侧大腿外侧毛发，保证皮肤完整无破损，然后取适量脱毛膏脱毛，直径约为3cm。大鼠俯卧位固定，局部皮肤常规无菌消毒，铺好无菌孔巾，用直径1.5cm 打孔器标记造模位置，剪取标记位置全层皮肤，造成直径1.5cm 圆形皮肤缺损，深度达皮下深筋膜。
造模成功后，24 只大鼠按随机数字表法随机分为模型组、复方五凤草液组、阳性药组（复方黄柏液），共3 组，每组8 只。
1.2.1.2 烧伤性溃疡动物模型［4］大鼠用10% 水合氯醛腹腔注射进行全身麻醉后，背部用电动剃刀剃毛暴露，将铜圆柱体模具（直径为1.8cm）置于100.0℃电热恒温水浴锅中10min，取出后立即置于大鼠背部8s，造成直径1.8cm 的深Ⅱ度烧伤创面。
选取造模成功的大鼠24 只，分为模型组、复方五凤草液组、阳性药组（康复新液），共3 组，每组8 只。
1.2.1.3 压力性溃疡动物模型［5］将SD 大鼠腹腔内注射10%水合氯醛麻醉， 然后在其背部剃出4cm×3cm 长方形皮肤区，使背部形成一个皮岛区域。然后用清水清洗，再用0.5 %碘伏溶液消毒。麻醉状态下于左肩下0.5cm 作一3.0cm 长的贯穿皮肤全层横切口，钝性分离后将经过高压蒸汽处理的环形铁片置于切口皮肤的尾端，铁片通过周围筋膜固定。然后缝合切口。将大鼠放回笼内。术后24 h 将1 块体外永久磁铁作用于大鼠背部植入区2h引起缺血，然后移开磁铁引起该区皮肤的血流再灌注0.5h，如此反复，每天5 个缺血-再灌注循环，连续3d。缺血-再灌注15 次，缺血时间总计30h。缺血-再灌注循环期间，大鼠给予标准饲料喂养及喂水，单独饲养以尽可能减小交叉反应或磁铁移位，在控制环境中允许自由活动。造模3d 后观察大鼠创面，以大鼠施压皮肤糜烂，针刺不出血作为判断Ⅲ期及以上压疮成模标准。
选取造模成功的大鼠24 只，分为模型组、复方五凤草液组、阳性药组（康复新液），共3 组，每组8 只。
1.2.1.4 糖尿病溃疡动物模型［6］大鼠适应性饲养1 周后，给予高脂高糖饲料，饲养4 周后，大鼠均禁食12h 后给予30mg/kg、1%STZ 溶液（临用前用0.1mol/L、pH4.5 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制）单次腹腔注射。注射后第3d 采用断尾取血法测血糖，随机血糖≥16.67mmol/L 为糖尿病造模成功；造模不成功者再次空腹12h后注射10mg/kg、1% STZ 溶液。4 周后，大鼠以水合氯醛腹腔注射进行麻醉，背部脱毛，常规消毒，在背部制作直径约为2.5cm 的圆形创面，深至皮下。
选取造模成功的大鼠24 只，分为模型组、复方五凤草液组、阳性药组（康复新液），共3 组，每组8 只。
1.2.2 给药方法 模型建立成功后，大鼠单笼饲养，保证大鼠日常自由饮水、摄食。自然暴露1d，第2d 即为实验开始日，记作实验第1d，开始进行药物干预，实验周期为14d，每日换药2 次。模型组：只用生理盐水清洗创面。治疗组：复方五凤草液2mL 外用换药，剪取适当棉片，以该液体2mL 浸湿（注意以轻挤不滴水为宜）外敷，无菌纱布包裹固定。阳性药组：根据不同动物模型，分别以复方黄柏液2mL、康复新液2mL 外用换药，剪取适当棉片，以该液体2mL 浸湿外敷，无菌纱布包裹固定。
1.2.3 检测方法 治疗第3d、第7d、第10d、第14d 每天早上对大鼠溃疡创面进行相机拍照，采用Adobe Photoshop CS5 软件图像处理创面，得创面面积。创面愈合率按如下公式计算：
创面愈合率=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积×100%
1.2.4 实验误差 实验过程中因大鼠的体质条件、健康状态和饲养环境等不可抗的客观因素存在，在实验结果中会出现偏离正常值较大的数据，为了使分析结果更符合客观实际，一般选择偏离较大的最大值或最小值将其剔除。
1.2.5 统计学方法 统计学方法采用SPASS19.0软件进行数据处理和分析，各组数据以（）表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 下肢静脉性溃疡动物模型 本研究中，与模型组相比，复方五凤草液给药第3、7d 显着促进了大鼠创面的愈合（t值=3.049，P=0.016＜0.05；t值=3.273，P=0.011＜0.05）。与阳性药相比，效果优于复方黄柏液，但无显着差异。给药第10、14d 时，各组大鼠的创面已基本趋于痊愈，组间没有显着性差异。见表1。
表1 复方五凤草液对大鼠下肢静脉性溃疡创面愈合率的影响（，n=8） %
表1 复方五凤草液对大鼠下肢静脉性溃疡创面愈合率的影响（，n=8） %
注：与模型组相比，*P＜0.05。
组别 第3d 第7d 第10d 第14d模型组 45.10±2.90 87.02±2.24 93.56±3.31 98.36±1.06复方五凤草液 61.98±4.71* 94.76±0.75* 98.92±0.68 100.00±0.00复方黄柏液 56.76±4.46 91.54±1.14 98.14±0.79 100.00±0.00
2.2 烧伤性溃疡动物模型 本研究中，给药前期（第3、7d）各组间无显着性差异。但是给药第10、14d 时，与模型组相比，复方五凤草液能显着促进大鼠创面的愈合（t值=2.319，P=0.49＜0.05；t值=3.429，P=0.09＜0.01）。与阳性药相比，效果略优于康复新，但无显着性差异。见表2。
表2 复方五凤草液对大鼠烧伤性溃疡创面愈合率的影响（，n=8） %
表2 复方五凤草液对大鼠烧伤性溃疡创面愈合率的影响（，n=8） %
注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
组别 第3d 第7d 第10d 第14d模型组 19.73±5.16 37.97±4.11 46.84±4.92 72.09±4.66复方五凤草液 22.06±1.59 37.63±3.92 58.67±1.36* 89.64±2.10**康复新 22.18±3.90 43.79±4.35 58.87±3.34 83.96±3.93
2.3 压力性溃疡动物模型 实验结果表明，复方五凤草液对大鼠压力性溃疡创面愈合的影响与模型组相比并无显着性差异。而阳性药康复新在给药第10、14d 显着促进大鼠创面的愈合（t值=4.197，P=0.002＜0.01；t值=2.635，P=0.025＜0.05）。见表3。
表3 复方五凤草液对大鼠压力性溃疡创面愈合率的影响（，n=8） %
表3 复方五凤草液对大鼠压力性溃疡创面愈合率的影响（，n=8） %
注：与模型组相比，*P＜0.05；**P＜0.01。
组别 第3d 第7d 第10d 第14d模型组 26.10±2.68 56.53±1.69 79.30±0.94 89.80±1.31复方五凤草液 22.55±2.03 58.28±3.52 80.88±1.51 89.08±0.78康复新 27.20±2.10 63.18±3.88 86.30±1.38** 94.23±1.05*
2.4 糖尿病溃疡动物模型 本研究中，复方五凤草液对大鼠创面愈合的影响与模型组相比并无显着性差异，而阳性药复方黄柏液能促进大鼠创面的愈合，并在给药第14d 出现显着性差异（t值=2.322，P=0.49＜0.05）。见表4。
表4 复方五凤草液对大鼠糖尿病溃疡创面愈合率的影响（，n=8） %
表4 复方五凤草液对大鼠糖尿病溃疡创面愈合率的影响（，n=8） %
注：与模型组相比，*P＜0.05。
组别 第3d 第7d 第10d 第14d模型组 34.38±4.18 49.86±4.78 60.68±5.60 84.24±1.37复方五凤草液 29.58±2.75 48.20±4.33 69.20±4.70 80.96±2.99复方黄柏液 40.90±2.24 62.36±3.82 73.10±3.70 88.54±1.24*
3 讨论
复方五凤草液为我院院内协定方，由五凤草、白芨、猫爪草等组方而成，方中五凤草行水杀虫、祛腐解毒［7］，白芨敛疮消肿、止血生肌［8］，猫爪草拔脓解毒，活血消肿［9］。诸药合用，共凑提脓祛腐，活血生肌之效，促进创面愈合。临床主要用于结核性溃疡等慢性创面的外用治疗，疗效确切，且安全可靠。在此基础上，我们通过结核性溃疡家兔模型从巨噬细胞活化角度［10］对复方五凤草液的作用机制做了初步探索，对M1、M2 型巨噬细胞［11］的表型指标iNOS、Arg-1 进行观察，前期研究结果表明复方五凤草液可能通过有效降低iNOS 的表达，促进Arg-1 的表达［12］，来平衡慢性难愈性创面中M1型募集、M2 型损耗的混合极化状态［13］促进创面愈合。这一点为我们开展复方五凤草液对多种慢性创面的药效学研究提供物质基础。
为了观察复方五凤草液对不同慢性创面的疗效，本次实验通过构建几种常见慢性难愈性溃疡的动物模型，设组比较观察该复方外用中药的疗效，对其药效进行初筛。
药效初筛实验表明：在下肢静脉性溃疡实验中，复方五凤草液给药前期能显着促进大鼠创面的愈合，而且效果优于复方黄柏液，但无显着性差异。给药后期，由于造模创口较小，各组大鼠的创面已基本趋于痊愈，组间没有显着性差异。整体来说，复方五凤草液能有效治疗大鼠下肢静脉性溃疡，促进其创面愈合。在烧伤实验中，复方五凤草液在给药后期能显着促进大鼠创面的愈合，效果略优于康复新，但无显着性差异。总的来说，复方五凤草液能促进烧伤创面的愈合，具有治疗效果。而在压力性溃疡及糖尿病溃疡实验中，复方五凤草液的表现不如阳性药物组，并不能更有效地促进溃疡愈合。这一点和我们的临床观察有出入，我们考虑下一步放大样本量，调整药物浓度后再做实验观察。总之本次实验结果表明：复方五凤草液能有效促进大鼠下肢静脉性溃疡、烧伤创面的愈合，可开展这两种溃疡模型的药效机制研究。
众所周知，慢性难愈性溃疡的起病原因多种多样，既能由某种特定细菌引发（结核性溃疡），也可由原有基础疾病并发而来（糖尿病溃疡，静脉性溃疡），使得临床上西医的治疗手段相对局限。加上其易缠满反复的特点，且创伤机理研究尚不完善，慢性难愈性溃疡已经成为临床上困扰患者和医疗工作者的巨大难题。而祖国传统的中医药外治在创面修复中扮演了极为重要的角色。复方五凤草液是我院治疗结核性溃疡的院内制剂，前期已有大量数据表明其在治疗结核性溃疡方面的临床效果显着，并且其机理研究也有了很大的发现。通过这个实验，我们认为复方五凤草液的治疗并不局限于结核性溃疡，对其他如下肢静脉溃疡、烧伤性溃疡等创面也有十分明显的治疗效果，这一结论为其进一步的药效机制研究提供了依据，也为其以后拓宽临床应用范围打下了基础。
