陈丹丹，董 博，欧国峰，王国柱，肖 斌，陈 瑞，袁普卫，方 晴
1 陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2 陕西中医药大学附属医院；3 陕西中医药大学第二附属医院
骨质疏松症是一种全身性代谢性疾病，主要表现为骨量低下或骨微观结构改变，进而引起骨脆性和骨折风险增加［1］。据不完全统计，目前世界上原发性骨质疏松症患者已超过2 亿，世界卫生组织将其列为老年人三大疾病之一［2］。本病属祖国医学“骨痿”“骨痹”等范畴，虽然其病因和发病机制尚未完全阐明，但中医药治疗具有明显优势［3-5］。抗疏强骨颗粒是陕西中医药大学第二附属医院院内制剂，在治疗原发性骨质疏松症方面取得了良好效果［6］。本研究旨在观察抗疏强骨颗粒对去卵巢模型大鼠血清碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和人抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase 5b，TRACP5b）的影响，探讨其作用机理。
1 材料与方法
1.1 实验动物选用6 月龄清洁级未怀孕雌性大鼠100 只，体质量约（200±50）g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，检疫符合实验研究标准，生产许可证号：SCXK（陕）2017-003。
1.2 实验药物抗疏强骨颗粒由陕西中医药大学第二附属医院中草药房提供，药物组成：黄芪30 g，熟地黄15 g，淫羊藿15 g，肉苁蓉15 g，菟丝子15 g，当归12 g，丹参12 g，三七6 g，延胡索15 g，白芍12 g，骨碎补15 g，牛膝15 g，甘草10 g，1 g干浸中药粉末相当于2.83 g生药。
1.3 实验主要试剂与仪器ALP 试剂盒（批号：
AR0019）、TRACP5b 试剂盒（批号：ST1021）均由陕西博达生物科技有限公司提供；苏木素染液（批号：ST047）；伊红染液（批号：G1120）均由北京索莱宝科技有限公司提供；固定板、手术器械、离心管、移液枪、EP 管等；2135 型石蜡切片机（德国莱卡）；DM400B生物显微镜（日本OLYMPUS公司）。
1.4 方法
1.4.1 造模方法 除正常组外，其他组大鼠适应性喂养1 周后开始造模，造模前将大鼠禁食、禁水24 h，10%水合氯醛（0.15 mL/100 g）腹腔内注射麻醉，待大鼠进入睡眠状态（麻醉满意）后俯卧固定，剔除腰脊背部两侧毛发，用湿纱布擦拭，手术部位擦干净后进行局部消毒，沿腰椎左侧切开1 cm 皮肤，取出筋膜，分离肌肉后可见肾脏外下方呈淡粉色的卵巢及紧密相连的子宫角，在子宫上端及下部输卵管部位结扎［7］，切断子宫角，摘除卵巢并称重，用同样的方法切除右侧卵巢，清洗后依次逐层关闭切口，齿镊对皮后缝合皮肤，伤口涂抹红霉素并用消毒纱布包扎。术后臀肌注射青霉素（40 万IU/kg）7天，每天1次，预防感染。该“切除双侧卵巢”造模方法于1969年由Saville最先建立，经过长期反复实验验证，具有可靠性，国内外应用广泛［8］。饲养90 天后造模组大鼠出现反应迟钝、精神不振等症状，骨组织病理切片示出现骨质疏松病理改变，提示造模成功。
1.4.2 分组及给药 根据随机数字表法将造模后的大鼠分为模型组和中药（大、中、小剂量）组，另设未造模正常组，每组20 只分笼饲养，予抗生素常规喂养7日后开始给药，中药大、中、小剂量组按照相应剂量灌胃给药（2.865、1.432、0.714 mg/kg）抗疏强骨颗粒，均分别制成2 mL 溶液灌胃），每日1 次，每周6 次，连续给药3 个月，正常组和模型组正常饲养不给药。为计量准确，灌胃期间，每2 周用电子天枰称体质量1次。
1.4.3 标本采集 正常组正常饲养2 周、模型组于造模成功后处死取材。其余各组在完成3 个月灌胃给药后，10%水合氯醛（0.15 mL/100 g）腹腔内注射麻醉（取材前1 天需禁食24 h），待麻醉满意后腹部备皮消毒。1）取血：沿腹部中线切开至腹腔，拔开肠管在腹腔后壁可见腹主动脉，用采血针穿刺腹主动脉将血标本采集在负压采血管中3 mL，拔除采血管。将血液离心后取上清液，离心半径10 cm，3000 r/min，离心20 min，放入无菌EP 管置于-80℃冰箱保存备用。2）骨组织切片取材：取大鼠右侧股骨去除肌肉和筋膜，保留骨膜部分，取出股骨远端，置于10%福尔马林溶液中固定24 h，然后置于10%脱钙液中，脱钙液每天更新，直到可以用大头针轻轻刺入，大约用时3周。
1.4.4 观察指标 观察正常组、模型组和中药（大、中、小剂量）组给药前后大鼠一般情况（包括体质量、精神状态、毛发颜色和光泽等）；使用ElISA 方法检测大鼠血清ALP 和TRACP5b，绘制相关曲线以确定其含量；将脱钙后的股骨标本常规包埋并用HE 染色观察镜下骨小梁结构及骨细胞和骨髓脂肪细胞的形态。
1.5 统计学方法应用SPSS 19.0 统计软件分析数据，计量资料以表示，采用单因素方差分析，组间多重比较方差齐用LSD-t检验，方差不齐用Tambane's T2 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况正常组大鼠除体质量增加外，其他（精神状况、毛发颜色和光泽等）无明显异常；手术当天，所有造模大鼠精神较差，活动较少，术后第4 天精神状态和活动基本恢复正常，能够正常饮水和进食。造模组大鼠造模90 天后精神状况较差，毛发颜色晦暗无光泽，体质量下降显着，偶有毛发脱落等；给予相应剂量药物灌胃后大鼠精神状况尚可，毛发色泽较正常组稍差，体质量轻微下降，整体接近正常组大鼠状态。
2.2 各组大鼠股骨病理切片正常组大鼠细胞结构清晰，大小、形态正常；模型组软骨细胞显示有空骨陷窝，细胞核聚缩，且排列不整齐，骨小梁内骨细胞明显减少；中药（大、中、小剂量）组软骨细胞排列规则，结构完整，空骨陷窝罕见，接近正常组。见图1。
图1 各组动物骨组织HE染色结果（×40）
2.3 血清ALP 及TRACP5b 含量与正常组比较，模型组血清ALP及TRACP5b含量上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药大、中、小剂量组血清ALP及TRACP5b含量下降，中剂量组含量最低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。
表1 各组大鼠血清ALP及TRACP5b含量（)
表1 各组大鼠血清ALP及TRACP5b含量（)
注：*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05；△表示与中药中剂量组比较，P＜0.05
3 讨论
骨质疏松症是一种全身性骨病，系因各种原因导致骨量减少或骨微结构改变，最终因骨骼变脆易于发生骨折［9-10］。有研究［10］表明绝经后骨质疏松的发生与体内雌激素分泌水平有密切联系，雌激素对骨代谢具有调节作用。祖国医学认为人体是一个有机整体，五脏六腑、气血阴阳之间相互作用和影响，肾主骨，肾精不足则骨髓不满，故从肾论治各医家达到共识［11-13］。肝肾同源，主疏泄，主藏血，两者之间互相转化，若肝失疏泄，血与精津液生产及运行受到影响，骨不得充，筋骨不坚，引起疼痛［14-15］。陕西省名中医刘德玉教授认为骨瘘（骨质疏松症）是因人素体虚弱，脏腑虚衰，耗损正气，以致肝肾亏虚为本，正气不足，无力生血行血，血行不畅，筋骨经脉不得濡养，导致骨质疏松性骨折，肝肾不足是基础，以补益肝肾为治疗大法。“抗疏强骨颗粒”以黄芪、熟地黄为君，益气助阳、补肝益肾；仙灵脾、肉苁蓉、菟丝子补肾健脾，强筋健骨；当归、丹参、三七活血化瘀补血；延胡索、白芍活血止痛；骨碎补、牛膝补肝肾强筋骨；甘草益气止痛，调和诸药。组方立法严谨，既不忘补肝肾强筋骨，同时兼活血化瘀止痛，标本兼治，正中病因病机。
TRACP5b 是破骨细胞分泌的糖基化蛋白酶，是人体骨吸收的敏感指标。人体血清中存在TRACPa、TRACPb 两种类型，且二者含量相近，来源不同，在唾液酶作用下二者可相互转化。来源于巨噬细胞的TRACPa 无酶活性，破骨细胞分泌的TRACPb 具有酶活性，且不受肝肾代谢影响，昼夜数值较稳定，具有广泛的应用性。SALMINEN 等［16］通过临床观察发现TRACPb 是一个敏感度高、可靠性强的骨吸收检测指标。向青等［17］对大量正常及骨质疏松患者临床研究发现其血清TRACPb水平不同程度升高，证实TRACPb 是一个较好的骨吸收指标，可在一定程度上代替骨密度仪作为反映骨丢失速率的重要指标。碱性磷酸酶ALP 是反应骨转换的常用指标，其在人体中分布广泛，血清ALP 主要来源于骨组织与肝脏。相关研究［18-20］表明碱性磷酸酶与骨矿物质化密切相关，碱性磷酸酶水平可反映成骨细胞活性，是目前评估人体骨矿化障碍的最佳指标。本实验选取大鼠作为实验动物，具有价格低廉，喂养方便，与人体解剖结构相似，更易建立骨代谢与吸收平衡等一系列优点，采用切除大鼠双侧卵巢这一经典造模方法，模拟人绝经后雌激素下降状态，采用HE 染色观察造模成功与否以及其骨组织病理学改变，通过TRACP5b、ALP水平检测骨代谢情况，进一步探讨中药抗疏强骨颗粒治疗作用与TRACP5b、ALP的相关性，为骨质疏松的中医药防治提供一定的实验基础。
本研究结果表明，绝经后骨质疏松大鼠血清TRACP5b、ALP 上升，其原因可能与骨质疏松的病因有关，抗疏强骨颗粒能降低去卵巢模型大鼠血清TRACP5b、ALP 含量，其中中剂量效果最显着。由此得知抗疏强骨颗粒通过降低去卵巢模型大鼠血清ALP、TRACP5b 水平，降低破骨细胞活性，抑制骨吸收，从而治疗绝经后骨质疏松症。
