基于网络药理学挖掘银翘马勃散治疗喉源性咳嗽的作用机制※

张文强 肖 航 熊少斌 李可可 胡君霞 许越淇 严诏琦 刘良徛

喉源性咳嗽是着名耳鼻喉专家干祖望所提出的以“咽痒作咳”为主要特征的阵发性痉挛咳嗽[1]。其临床表现为咽痒即咳、少痰或无痰，遇寒冷空气、刺激性气味时加重[2]。近年来因为气候和环境的改变，该病发病率逐渐上升[3]。西药治疗方案主要以抗生素和激素为主，不仅疗效不佳，且易导致抗生素的耐药，近年来的临床报告显示，中医药治疗喉源性咳嗽效果显着，且不良反应小[4]。刘良徛教授常以银翘马勃散加减治疗各类咳嗽，并取得良好的临床疗效[5]。黄明儒等[6]发现银翘马勃散联合穴位贴敷治疗喉源性咳嗽能够有效缓解患者的症状，临床疗效显着。但目前关于喉源性咳嗽的病因仍不十分明确，还未形成系统和规范的认识[7]，同时，对药物治疗喉源性咳嗽的作用机制也鲜有挖掘。

银翘马勃散出自清代吴鞠通的《温病条辨》，该方具有清热、解毒、利咽、除湿的功效。该方组成为金银花、连翘、马勃、牛蒡子、射干。方中金银花、连翘清热解毒、轻宣散邪；牛蒡子疏散风热、解毒利咽散结；射干解毒、消痰、利咽；马勃清肺利咽、止血。诸药配伍使上焦郁热得除，肺气得宣，咳嗽得治。现代药理学研究中，金银花含有萜类化合物、黄酮类化合物等有效成分，具有消炎抗菌、降血脂、抗内毒素、抗氧化等作用[8]。连翘含有连翘苷、连翘酯苷等有效成分，具有抗病毒、抗炎镇痛、抗菌、抗氧化等作用[9]。牛蒡子含有木脂素类、挥发油、脂肪油类、帖类等有效成分，具有抗菌、抗病毒、扩张血管、抗肿瘤、降血糖等作用[10]。射干含有鸢尾苷、射干醇等有效成分，具有抗炎、抗病原微生物、抗溃疡等作用[11]。马勃含有甾体化合物、萜类化合物、酰胺类化合物等有效成分，具有抗炎、止咳、止血、抗肿瘤等作用[12]。这提示银翘马勃散治疗喉源性咳嗽有确切的依据。但是中药复方含有众多化合物成分，并作用于多种细胞靶标，故难以用常规方法分析其协同作用机制。本研究通过网络药理学挖掘银翘马勃散的有效成分及靶点，分析药物与疾病复杂和多层次的交互网络，并进行可视化网络图的构建，进而阐明银翘马勃散治疗喉源性咳嗽的潜在分子机制，为诊疗、新药开发提供新思路。

1 资料与方法

1.1 中药活性成分和潜在作用靶点的筛选和获取以银翘马勃散中金银花、连翘、牛蒡子、射干、马勃五味中药为关键词，分别录入TCMSP 数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcm-spsearch.php），并从中得到相关化学成分，将口服生物利用度（Oral Bioavailabili-ty，OB）≥30%和类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18 作为筛选条件，从而得到其活性成分，并以此挖掘其潜在作用靶点。利用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/），将得到的作用靶点进行匹配，并进行基因标准化处理，以便后续和疾病基因配对。

1.2 疾病靶点的获取以“laryngeal cough”为关键词，在数据库GeneCards（https：//www.genecards.org/）中检索，得到有关喉源性咳嗽的靶点信息。

1.3 药物-疾病共同靶点的获取分别将“1.1”中获得的基因标准化靶点与“1.2”中获得的喉源性咳嗽疾病的靶点，在Venny 2.1 平台录入，取其交集，并绘制韦恩图，最终得到银翘马勃散与喉源性咳嗽的共同靶点及数量。

1.4 药物-成分-靶点网络图的构建将“1.3”中所得到的共同靶点与“1.1”中获得的活性成分进行筛选匹配，将获得的数据与共同靶点导入Cytoscape 3.8.0软件中，构建药物-成分-靶点网络图。网络图中的节点（node）代表药物、成分和靶点；边（edge）代表药物、有效成分和靶点之间的相互作用关系。利用该软件中的“Network Analyzer”功能进行数据分析并记录，以便后续分析。

1.5 共同靶点PPI网络构建与核心靶点的获取将“1.3”所获得的共同靶点导入STRING 在线分析平台（https：//www.string-db.org/），物种类别选择“Homo sapiens”，并分析获得蛋白质-蛋白质相互作用（Protein protein Interaction，PPI）网络图。将所得数据导入Cytoscape 3.8.0软件，根据Between值大小进行排序筛选，得到药物治疗疾病的核心靶点。

1.6 GO 富集分析、KEGG 通路富集分析将“1.5”得到的核心靶点导入Metascape 在线分析工具（https：//metascape.org/），并将物种类别设置为“H.sapiens（26）”，分别进行（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路、GO Molecular Functions、GO Biological Processes、GO Cellular Components 富集分析，将得到的数据按照Score分值进行筛选，选取符合条件的前10 条KEGG 通路、前13 条生物过程（Biological Processes，BP）、前7 条细胞组成（Cellular Component，CC）、前10 条 分 子 功 能（Molecular Function，MF），并进行数据可视化处理。

2 结果与分析

2.1 银翘马勃散活性成分及靶点获取通过TCMSP数据库，共检索出活性成分76 个，其中金银花23 个、连翘23个、牛蒡子8个、射干17个、马勃5个。去除重复和无靶点对应的成分后，一共得到33个活性成分；共获取药物有效成分潜在作用靶点215个。见表1。

表1 银翘马勃散活性成分

2.2 喉源性咳嗽基因靶点获取通过GeneCards 数据库共获得喉源性咳嗽相关基因靶点1399个。

2.3 药物-疾病共同靶点获取分别将筛选后的药物和疾病基因靶点在Venny 2.1平台录入，取其交集，并绘制韦恩图，最终得到共同基因靶点112 个。见图1。

图1 药物-疾病共同靶点韦恩图

2.4 药物-成分-靶点网络图构建将药物、活性成分、共同靶点数据导入Cytoscape 3.8.0软件中，构建三者网络图。其中黄色元素代表银翘马勃散的5 种药物；棕色元素代表药物和疾病112 个共同靶点；紫色元素代表银翘马勃散中22 种活性成分（11 种活性成分靶点和疾病靶点无交集，予以删除），单个元素大小代表相互关系程度，越大说明该成分在银翘马勃散中发挥的作用越明显。结果明显发现银翘马勃散中的木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、β-胡萝卜素（beta-carotene）、汉 黄 芩 素（wogonin）、柱 头 甾 醇（Stigmasterol）代表值相对较大。其中，木犀草素见于金银花、连翘、射干中；槲皮素见于金银花、连翘中；山柰酚见于金银花、连翘、牛蒡子中；β-谷甾醇见于金银花、连翘、牛蒡子、马勃中；β-胡萝卜素见于金银花、牛蒡子中；汉黄芩素见于连翘中；柱头甾醇见于金银花中。结果表明这些成分具有相互协同治疗喉源性咳嗽的作用，同时也说明中药复方是通过多成分、多靶点起到治疗喉源性咳嗽的作用。见图2。

图2 药物-成分-靶点-疾病相互作用图

2.5 靶点基因PPI 网络图构建将112 个共同基因录入STRING 在线分析平台，将物种设置为人类（Homosapiens），并分析得到PPI 网络图，图中节点数112，边数2151，平均节点度38.4，每条边代表蛋白间的相互作用关系。将得到的数据导入Cytoscape 3.8.0软件中，根据Between值进行排序筛选，得到核心靶点分别为AKT1（蛋白激酶B）、TP53（肿瘤抑制基因）、TNF（肿瘤坏死因子）、ESR1（雌激素受体α）、MYC（原癌基因）、EGFR（表皮生长因子受体）、IL6（白介素6）、CAV1（小窝蛋白-1），预测在治疗过程中发挥关键作用的是这些核心靶点。见图3、图4。

图3 银翘马勃散“成分-靶点”蛋白互作PPI图

图4 “成分-疾病”核心靶点网络图

2.6 GO 富集分析将上述得到的核心靶点录入Metascape 平台进行通路信号分析，并通过生物信息学平台对结果进行可视化分析。共选取与研究有关的前13 条生物过程（Biological Processes，BP），如：血管内皮生长因子产生（vascular endothelial growth factor production）、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录响应缺氧的阳性调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter in response to hypoxia）、乳腺肺泡发育（mammary gland alveolus development）、阳性调节发热（positive regulation of fever generation）、调节一氧化氮合酶活性（regulation of nitric-oxide synthase activity）等；前7 条 细 胞 组 成（Cellular Component，CC），如：转录抑制复合物（transcription repressor complex）、膜筏（membrane raft）、血小板α 粒腔（platelet alpha granule lumen）等；前10 条分子功能（Molecular Function，MF），如：一氧化氮合酶调节活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、细胞因子受体 结 合（cytokine receptor binding）、ATP 酶 结 合（ATPase binding）、生长因子受体结合（growth factor receptor binding）等。见表2、图5。

图5 GO富集分析结果网络图

表2 银翘马勃散治疗喉源性咳嗽的GO分析

2.7 KEGG 通路富集分析将上述核心靶点录入Metascape 平台进行通路信号分析，并通过生物信息学平台对结果进行可视化分析。筛选出符合研究的前10 条关键通路：癌症通路（Pathways in cancer）、人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）、C 型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、RIG-I 样受体信号通路（IRIG-I-like receptor signaling pathway）、Toll 样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、甲型流感（Influenza A）、神经变性的途径 - 多种疾病（Pathways of neurodegeneration -multiple diseases）、NOD 样受体信号通路（NOD-like receptor signaling pathway）、IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）。其中，与喉源性咳嗽相关的通路可能是C 型凝集素受体信号通路、TNF 信号通路、RIG-I样受体信号通路、Toll 样受体信号通路、NOD样受体信号通路、IL-17 信号通路等。见表3、图6。

3 讨论

本研究通过网络药理学共筛选到银翘马勃散中药物活性成分作用靶点215个，喉源性咳嗽相关基因靶点1399个，最终获得疾病与药物共同基因靶点112个。从药物-成分-靶点网络图分析可知，该网络图一共有节点139个，边362条，其中金银花占12条，连翘9 条，射干5 条，牛蒡子4 条，马勃2 条。金银花的degree值位居首位，表明金银花在该方治疗喉源性咳嗽中占主导地位，连翘、射干次之；牛蒡子、马勃起到辅佐作用。同时发现银翘马勃散中主要活性成分为：木犀草素、槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、β-胡萝卜素、汉黄芩素、柱头甾醇等。木犀草素是一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗过敏和免疫增强功能，能减轻哮喘气道炎症和超敏反应[13]。Pio C 等[14]发现木犀草素、IL-37和IL-38都是具有不同信号通路的抗炎分子，并认为木犀草素与这些抗炎细胞因子联合用于炎症具有相关性。槲皮素是一种黄酮类化合物[15]，其在医学领域有着抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎等作用[16]。Jingwen等[17]发现其可能通过调节PI3K/Akt 信号通路发挥抗炎作用。山柰酚是一种黄酮醇类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗凋亡等活性，在正常情况下，能够提高脾淋巴细胞活力，促进淋巴细胞增殖，加强机体的免疫应答[18]。陈丹等[19]发现山柰酚能够有效减轻小鼠急慢性炎症性疼痛，改善足底造模部位炎症情况，减轻炎性因子的聚集情况，使造模后小鼠对机械刺激和热刺激的敏感性降低。β-谷甾醇是一种具有天然生物活性的甾体化合物，具有抵抗细菌入侵、消炎镇痛、抗氧化、抗肿瘤等作用[20]。贾菊芳等[21]发现，β-谷甾醇能够改善OVA 诱导的过敏性哮喘大鼠气道炎症和氧化损伤，其作用机制可能与β-谷甾醇对Th17/Treg 免疫失衡及氧化应激反应调节有关。β-胡萝卜素是常见类胡萝卜素之一，具有抗氧化、清除自由基、保护血管、抗肿瘤、增强免疫功能及保护神经系统等作用[22]。汉黄芩素是一种天然黄酮类化合物，可通过调节PI3K-Akt、p53、核因子κB （NF-κB）等多种细胞信号通路发挥抗炎、抗肿瘤、抗病毒、神经保护和抗焦虑作用[23]。柱头甾醇可增强一氧化氮的产生，并作为潜在的抗氧化剂和增强免疫力的药物发挥治疗作用[24]。Opoku等[25]发现柱头甾醇对卵蛋白诱导的气道炎症损伤具有明显的抑制作用。此外，该方核心成分多为黄酮类化合物，如：槲皮素、木犀草素、汉黄芩素等。这表明该类天然化合物在治疗喉源性咳嗽中可能发挥主要作用。黄酮类化合物广泛存在于中草药中，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗血栓等常见的药理活性和多靶标协同的特点[26]。该类化合物对改善气道重塑是否也具有明显的药理活性作用有待进一步研究。卢秋生等[27]从中药复方中提取的天然黄酮类化合物在卷烟实验中可降低烟气对咽部的刺激。

银翘马勃散治疗喉源性咳嗽核心靶点为AKT1、TP53、TNF、ESR1、MYC、EGFR、IL6（白介素6）、CAV1。Akt 有3 种亚型，分别是 Akt1、Akt2、Akt3，由3 个不同的基因进行编码，这3种亚型具有高度的同源性，在多种组织中广泛表达[28]。AKT1 可通过阻断PI3K/Akt 信号转导通路，以抑制杯状细胞增生引起的黏液高分泌，从而减少气道高反应，并阻止气道结构改变[29]。TNF-α 是一种细胞因子，是气道炎症产生的重要启动因子之一[30]。TP53、TNF α 诱导气道平滑肌产生力增强，并可介导多种炎症反应，导致气道炎性反应加重，诱发高气道反应[31]。ESR1 是一种雌激素受体。程力等[32]发现雌激素可能通过气道黏膜中的肥大细胞ESR1受体表达的变化参与女性患者哮喘发病的过程。C-MYC 是存在于正常细胞中能编码关键性调控蛋白的一类基因，在支气管上皮细胞和内皮细胞均有部分表达，阻断其表达则可控制患者气道重塑的症状[33]。EGFR 是一种表皮生长因子受体，是气道上皮细胞功能的调控者[34]。香烟可使气道上皮杯状细胞显着增生，研究表明，可通过EGFR-酪氨酸激酶抑制剂来防止[35]。IL6是一种具有多种生物学功能的前炎症因子，可出现在人气道上皮细胞损伤和炎症反应时，在免疫调节、炎症反应、细胞的增殖分化等过程中均有重要的作用[36]。CAV1在气道上皮细胞、内皮细胞等结构细胞中均有所表达，通过抑制CAV1 的表达可以降低LPS 诱导的气道黏液高分泌，这为治疗慢性气道炎症性疾病提供了一个可能有现实意义的治疗靶点[37]。高健等[38]发现CAV1与FOXM1可能通过互相影响，反向刺激，在气道重塑和呼吸道炎症中发挥重要作用。

GO富集分析主要涉及RNA聚合酶Ⅱ启动子转录响应缺氧的阳性调控、血管内皮生长因子产生、乳腺肺泡发育、阳性调节发热、调节一氧化氮合酶活性等生物过程；细胞组成如：转录抑制复合物、膜筏、血小板α粒腔等；分子功能如：一氧化氮合酶调节活性、细胞因子受体结合、ATP酶结合、生长因子受体结合等。KEGG 通路分析发现，银翘马勃散治疗喉源性咳嗽的靶点主要在C 型凝集素受体信号通路、TNF 信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路、Toll 样受体信号通路、NOD 样受体信号通路、IL-17 信号通路上富集。C 型凝集素受体主要在树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等免疫细胞表面表达，其可促进免疫细胞分泌 IL-6、TNF-α 等多种促炎细胞因子，并启动适应性免疫应答[39]。TNF信号通路近年来研究显示，肿瘤坏死因子-α（ TNF-α）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路异常激活与哮喘气道黏液高分泌有密切的关系，通过抑制TNF-α/NF-κB 信号通路可缓解气道黏液高分泌[40]。Toll 样受体是一种固有免疫病原模式识别受体，激活其信号传导通路会加重气道炎症及气道高反应性，引起炎症因子释放[41]。内源性和外源性配体激活Toll受体可以破坏“黏膜稳态”状态与“黏膜损伤”状态之间的平衡，从而导致黏膜炎症和屏障破坏[42]。NOD样受体信号通路在宿主抵御感染的第一道防线中起着至关重要的作用，其配备识别病原体相关分子模式和损伤相关分子模式，可直接激活免疫细胞[43]。RIG-Ⅰ样受体是细胞质中的一类 RNA 解旋酶，属于固有免疫的模式识别受体，其在Ⅰ型干扰素、促炎细胞因子产生等方面起到重要作用[44]。IL-17是一种促炎细胞因子，在机体的防御、组织修复、炎症性疾病的发病和癌症的过程中有着重要作用，其受体信号通路在炎症和癌症中对真菌和细菌以及病理条件下有正常保护作用[45]。IL-17A 可作用在气道上皮细胞、气道平滑肌细胞、气道成纤维细胞上，并均有助于气道重塑的发生[46]。

综上所述，本研究通过网络药理学挖掘银翘马勃散治疗喉源性咳嗽的潜在作用机制发现，银翘马勃散是通过多成分、多靶点、多通路参与治疗喉源性咳嗽，这为临床治疗提供了更多研究基础。