强精煎对少弱精子症大鼠精子腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶基因表达的影响❋

宾彬，陆海旺，王杰，王德胜，徐杰新，覃智标，梁劲松，庞秋华，崔锦珠

(广西中医药大学第一附属医院，南宁530023)

强精煎对少弱精子症大鼠精子腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶基因表达的影响❋

宾彬，陆海旺△，王杰，王德胜，徐杰新，覃智标，梁劲松，庞秋华，崔锦珠

(广西中医药大学第一附属医院，南宁530023)

目的:探讨健脾益肾中药强精煎对少弱精子症模型大鼠附睾精子腺苷酸环化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)基因表达影响。方法:80只成年SD大鼠按随机数字表法分成4组，正常组大鼠每天给予生理盐水，模型组给予奥硝唑(ornidazde，ORN)800 mg/(kg·d)，黄精赞育胶囊组给予［ORN800 mg/(kg·d)+黄精赞育胶囊400 mg/(kg·d)］，强精煎组大鼠每天给予［ORN800 mg/ (kg·d)+强精煎10 g/(kg·d)］，4周后取各组大鼠附睾组织，实时荧光定量PCR进行AC、PDE基因表达的测定。结果:强精煎组大鼠PDE基因表达水平显着低于模型组，而AC基因表达水平显着高于模型组。结论:强精煎中药可明显下调少弱精子症模型大鼠附睾精子PDE基因表达水平并显着上调其AC基因的表达水平，可能是其治疗少弱精子症的机制之一。

强精煎;腺苷酸环化酶;磷酸二酯酶;少弱精子症

少弱精子症是男性不育的常见原因，其中弱精子症占男性不育患者的很大部分［1］。因此，精子运动障碍和精子活动力低下的分子机制一直是男性生殖研究的热点。研究显示［2］，与活动力正常的精子比较，在精子活力低下患者中，精子可溶性腺苷酸环化酶(soluble adenylylcyclase，sAC))的表达减少和磷酸二酯酶PDE4C的表达增加。另外有报道，可溶性腺苷酸环化酶(sAC)基因敲除的雄性小鼠均出现精子运动障碍和不育［3］。健脾益肾中药强精煎是笔者临床治疗少弱精子症的经验方。前期研究表明，该复方可显着改善少弱精子症患者的精子密度和活力［4］。本研究通过建立少弱精子症模型大鼠，探讨强精煎对少弱精子症大鼠附睾腺苷酸环化酶和磷酸二酯酶基因表达影响，以揭示其治疗少弱精子症的部分可能机理。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级成年雄性SD大鼠80只，体质量(280± 10)g，由广西医科大学实验动物中心提供(许可证号SCXK桂～0004)。

1.2 药物

中药强精煎由菟丝子、枸杞子、当归、黄芪、党参、续断、益母草、神曲等组成［4］，采用单味中药配方颗粒(江阴天江药业有限公司生产);黄精赞育胶囊由何首乌、黄精、菟丝子、枸杞子、五味子、熟地黄等组成(上海新亚药业邗江有限公司生产);奥硝唑胶囊(ORN，四川百利药业有限公司生产)。

1.3 主要仪器和试剂

实时荧光定量PCR试剂盒Real Master Mix SYBR Green(天根生化科技(北京)有限公司); Trizol(天根生化科技(北京)有限公司);TaKaRa MMLV RTase cDNA Synthesis Kit(大连宝生物工程有限公司);裂解液RZ(天根生化科技(北京)有限公司);AC、PDE、β-actin引物(天根生化科技(北京)有限公司);UV-240紫外-可见光分光光度计(北京谱朋科技有限公司);PCR扩增仪(Eppendorfmastereyelergadient，德国);DNA Engine OpticonTM 2 CFD-3220型连续荧光检测系统(美国MJ Research公司)。

1.4 动物分组与处理

大鼠适应性喂养1周后按随机数字表法分成4组。造模方法参考熊芬法［5］:正常组大鼠每天给予生理盐水，模型组给予ORN800 mg/(kg·d)，黄精赞育胶囊组(阳性对照)给予［ORN800 mg/(kg·d)+黄精赞育胶囊400 mg/(kg·d)］，强精煎组大鼠给予［ORN800 mg/(kg·d)+强精煎配方颗粒10 g/(kg· d)］。试验药物均以生理盐水新鲜配制成混悬液，每天每只大鼠灌以4 ml各组溶液，每日1次，连续4周。大鼠每周称重1次以调整给药剂量。

1.5 标本采集与处理

末次给药24 h后，各组大鼠分批以10%乌拉坦麻醉，取睾丸附睾组织约100 mg，剪碎后加入1 mLTrizol试剂于-80℃冰箱保存，以备总RNA的提取。

1.6 实时荧光定量测定

按Trizol说明书方法提取附睾组织的总RNA，紫外-可见光分光光度计测定OD值分析提取RNA的纯度和浓度，确保OD值在1.8～2.0之间，置于-80℃冰箱保存;逆转录(10 μl体系):5× PrimeScript Buffer 2 μl，Oligo dT Primer(50 μM)0.5 μl，dNTP mixture(10 μM each)0.5 μl，Random 6 mers(100 μmol/L)2 μL，将总RNA逆转录成cDNA，根据RNA浓度(ng/μl)，参考Takara试剂盒说明书，所加入RNA最大量为500 ng，计算所加体积(μl)，以RNase ddH2O补至5 μl，反应条件:37℃15 min，85℃5 s;实时荧光定量PCR反应:反应体系20 μl，引物序列:PDE(71 bp)。上游引物:5’ACA GGGGCTTCAGTAACAGC3’，下游引物:5’GGTGG AGGTGGAGTACAA CG3’;AC(159 bp)，上游引物: 5’GCAAGGACACCTCTCCGTC3’，下游引物:5’AGAGTCCAGAGTCCCAGGTC3’;β-action(150bP)，上游引物:5’CCCATCTATGAGGGTTACGC3’，下游引物:5’TTTAATGTCACGCACGATTTC3’。扩增条件:①94℃15 min，94℃10 s，55℃20 s，72℃20 s，45个循环;②72℃5 min。扩增后根据Ct值计算各基因的相对表达量，每个样本检测重复3次。

1.7 统计学方法

以β-action为内参照基因，各待测基因的Ct值均用其对应β-action基因的Ct值进行标准化。采用PEMS 3.1软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，组间比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1图1显示，强精煎组可以明显下调PDE基因表达水平，上调AC基因表达水平，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠附睾AC、PDEmRNA相对表达量比较(±s)

表1 各组大鼠附睾AC、PDEmRNA相对表达量比较(±s)

注:与模型组比较:▲P＜0.05;与正常组比较:#P＜0.05

组别鼠数ACmRNAPDEmRNA正常组2011模型组200.58±0.06#1.33±0.07#黄精赞育胶囊组201.42±0.08▲#0.75±0.07▲#强精煎组202.40±0.46▲#0.53±0.06▲#

图1 各组大鼠附睾AC、PDEmRNA相对表达量比较

3 结论

环核苷酸磷酸二酯酶超家族(cyclic nucleotidephosphodiesterases，PDEs)共有11位成员，作为不可或缺的环核苷酸信号调节器，参与大量的生理学过程。环核苷酸环化酶(AC和GC)合成环核苷酸，PDEs是细胞内重要的第二信使cAMP和cGMP催化水解酶［6］，主要功能在于切割水解细胞内的cAMP和(或)cGMP，导致其水平下降，继而使其下游蛋白激酶G(PKG)活性减弱，从而调控各种生物学效应;发挥作用后的cAMP在磷酸二酯酶(PDE)的作用下转化成5-AMP而失去功能。cGMP能够促进精子获能以及顶体反应，提高精子的活力，并且还能促进精子新陈代谢，提高受精能力［7］，而PDE5能够水解cGMP，可见PDE5表达的增加将会降低细胞内cGMP的浓度，进而影响精子功能。因此，环核苷酸在细胞内信号通路以及PDEs在调节细胞内环核苷酸水平发挥作用，使其具有成为疾病治疗靶点的潜力［8］。

腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，AC)是广泛利用的信号传导通路中的一个效应分子，AC的产物cAMP在精子的获能、运动和顶体反应中有着重要的作用。Sinclair等［9］研究发现，sAC主要在精子、肾脏及脉络丛中表达，这表明它与男性生育力有关，精子功能是通过cAMP介导的。Ca2+、HCO3-及sAC在受精过程中起重要的作用［10-11］，而sAC在精子内有活性，它是保守的HCO3-、Ca2+传感器［9］，调节精子的功能，最终激活精子的运动力和超激活运动，与雄性动物的生育能力有关［3，12-13］。在精子获能过程中，精子尾部质膜发生改变，暴露或激活受体，进一步刺激异源三聚体鸟苷酸结合蛋白(G蛋白)，激活Ca2+通道，导致Ca2+内流进入胞内，激活腺苷酸环化酶，使胞内的cAMP浓度上升［14］。HCO3-直接作用于可溶性腺苷酸环化酶，引起cAMP浓度上升，激发cAMP-蛋白激酶的级联反应，轴丝和纤毛鞘的蛋白磷酸化使鞭毛呈高度不对称的快速鞭打运动，促使精子通过输卵管黏稠介质和穿越放射冠的弹性基质，增强精子摆脱输卵管上皮的能力，顺利完成获能［14］。一旦精子质膜的组成、物理性质或其他发生变化，导致Ca2+内流或HCO-浓3度上升，激活sAC，随之cAMP增加，进一步诱导Ca2+内流，使CatSper蛋白(精子阳离子通道蛋白)发生作用［12］。CatSper缺失的精子中，Ca2+内流受阻，没有足够的Ca2+激活sAC，反馈调节中断。由sAC合成的cAMP作用于邻近的效应目标，包括离子通道、CatSper和蛋白激酶A(proteinkinase A，PKA)。sAC介导产生的cAMP激活PKA，使轴丝和纤毛鞘蛋白发生磷酸化，加速鞭毛鞭打。sAC缺失小鼠精子中的AC活性和cAMP水平急剧下降，HCO3-不能加速鞭毛鞭打或使Ca2+进入sAC缺失的精子，进而影响精子运动和受精;sAC基因的定向裂解不影响精子发生，但显着破坏精子活动力，导致男性不育;sAC缺失小鼠的精子前向运动能力大部分丧失，在体外不能使卵子受精［14］。国外研究［3］发现，sAC缺失的雄鼠只有30%的精子能够继续向前运动，剩余的精子呈卷曲状。国内亦有研究［2］表明，当精子sAC的表达降低、PDE4C表达增加时，cAMP浓度降低，精子运动能力下降。

近年来，针对少弱精子症药物治疗虽然有了一定进展，但有明确疗效的药物仍不多见［15-16］。中医学认为，肾藏精，主生殖，肾精是生殖之精的物质基础，肾的精气有赖于脾胃运化水谷精微的培育和充养。另外，脾为生血之源，精血可以互化，脾运健旺，肾精得到脾化生的精微不断补充才能保持盈满，生殖之精也得以化生。因此，在少弱精子症的病机上笔者强调以“脾肾两虚”立论组方［4，17］。本方中重用枸杞子和黄芪，枸杞子味甘，归肝、肾经，补肝肾益精血;黄芪味甘微温，益气健脾，兼以利水，共为君药;紫河车、菟丝子、鹿角霜、川断味甘温，补肾生精;党参、当归味甘温，助黄芪益气养血生精，共为臣药;益母草味苦微寒、活血清热利湿，一物多用;五味子味酸甘温，滋肾涩精;牡蛎味咸微寒，益肾收敛固精，与五味子一起兼防阳浮精越而妄泄，共为佐药;神曲入脾、胃经，消食助运，以利受纳为使药。诸药合用，温而不燥，补而不腻，有补肾健脾、活血养血、清热利湿作用，共奏生精强精之功。

本实验采用大剂量奥硝唑复制少弱精子症大鼠模型，采用实时荧光定量PCR技术检测ACmRNA和PDEmRNA在附睾组织中的表达。结果显示，强精煎组大鼠附睾精子ACmRNA表达水平明显高于模型组，而PDEmRNA表达水平显着低于模型组。表明中药复方强精煎可通过上调附睾精子ACmRNA的表达，下调PDEmRNA表达来调节精子的功能，可能是其临床改善精子活力、治疗少弱精子症的分子生物学机制之一，为中医药治疗少弱精子症提供了新的研究思路，值得进一步深入探讨。

［1］徐廷云，胡嘉波，高华生，等.苏州地区2640例男性不育症患者精液质量分析［J］.中华男科学杂志，2011，17(6):511-515.

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［3］Esposito G，Jaisw al BS，Xie F，et al．Mice deficient for solub leadenylyl cyclase are infertile because of a severe spermmotilityd efect［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(9): 2993-2998.

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Effect of Qiang Jing Decoction on ACmRNA and PDEmRNA Expression of Oligoasthenozoospermia Rats

BIN Bin，LU Hai-wang，WANG Jie，WANG De-sheng，XU Jie-xin，QIN Zhi-biao，LIANG Jing-song，PANG Qiu-hua，CUI Jin-zhu

(The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning Guangxi，530023，China)

Objective:To study the affects of Qiangjing decoction on the AC、PDE gene expression of testis epididymis in rat with oligoasthenospermia.Method:Randomly divide 80 adult SD rats into control group，model group，Qiangjing decoction group and HuangJingzanyu capsule group(n=20).Delivery method:control group:normal saline given daily; model group:ORN 800 mg/(kg·d);HuangJingzanyu capsule group:ORN 800 mg/(kg·d)+Huang Jingzan Yu capsule 400 mg/(kg·d);Qiangjing Decoction group:ORN 800 mg/(kg·d)+Qiangjing Decoction10 g/(kg·d).Four weeks after the administration，we take the testis and epididymis of the rats and measure the AC、PDE gene expression by using Realtime PCR.Result:In Qiangjing Decoction group，the level of PDE gene expression is significantly lower than the model group;while the level of AC gene expression is higher than the model group.Conclusion:Qiangjing Decoction can certainly decrease the level of PDE gene expression and increase the AC gene expression of rats with Ligoasthenozoospermia.This may be one of the mechanisms of Qiangjing Decoction healing the oligoasthenospermia.

Qiangjing decoction;Adenylate cyclase;Phosphodiesterase;Oligoasthenospermia

R285.5

:B

:1006-3250(2015)05-0595-03

2015-02-22

国家自然科学基金地区科学基金资助项目(81060297)-健脾益肾法对少弱精子症大鼠的抗氧化作用及其调控机制的研究

宾彬(1964-)，男，广西平南人，教授，医学学士，从事男科学与生殖医学研究。

△通讯作者:陆海旺(1986-)，男(壮族)，广西南宁人，住院医师，医学硕士，从事中医男科疾病的临床与研究，Tel: 15977462577，E-mail:haivang@163.com。