侯俊林，詹向红，孙前明，关徐涛，刘 永，梁 鹤，闫国立，李 伟(河南中医药大学，郑州 450046)
【临床基础】
疏肝法对肝郁型MCI患者认知功能、尿8-OHdG及血浆SOD和LPO的影响❋
侯俊林，詹向红△，孙前明，关徐涛，刘 永，梁 鹤，闫国立，李 伟
(河南中医药大学，郑州 450046)
目的：探讨疏肝法对肝郁型MCI患者肝郁程度、认知功能、尿8-OHdG及血浆SOD和LPO的影响。方法：用国际MCI诊断标准和肝气郁结证症状筛选标准筛选40～65岁的肝郁型MCI患者，用肝气郁结证症状程度计分表对患者的肝气郁结程度进行评测，用MoCA量表和WAIS-RC量表简式对患者的认知功能进行评测，用ELISA法对患者用药前后的尿8-OHdG、血浆SOD和LPO进行检测。结果：与用药前比较，患者用药后肝气郁结证症状程度计分降低；MoCA量表的视空间与执行、注意、语言、抽象、延迟回忆、定向及总分均升高，命名得分无明显改变；WAIS-RC量表四合一简式的相似性、数字广度、填图、木块图和总分升高；8-OHdG含量降低，SOD及LPO值无明显变化。结论：疏肝法能降低肝郁型MCI患者的肝气郁结症状，改善患者的认知功能，降低DNA的氧化损伤是认知功能改善的可能原因。
疏肝法；肝气郁结；认知功能；氧化水平
轻度认知功能障碍(mild cognitive impairment，MCI)是正常衰老与痴呆之间的过渡状态[1]。MCI患病率在6.1%～16.1%之间[2-3]，随年龄的增长，约50%的MCI可进展为痴呆[4]。因此，积极研究MCI对防治痴呆有重要意义。临床观察发现，长期情绪调节不良的个体易较早出现认知功能下降。肝郁是情绪调节不良的常见证候，但疏肝法能否改善肝郁型MCI患者的认知功能尚未见报道。《金匮要略》云：“见肝之病，知肝传脾，当先实脾。”故本研究采用具有疏肝解郁健脾作用的逍遥丸作为疏肝方药，观察疏肝法对肝郁型MCI患者肝郁程度和认知功能的影响，并从衰老生物学角度探讨患者认知功能改变的可能原因。
根据现有循证医学证据，尚无药物可推荐用于MCI患者[5]，故本研究主要探讨疏肝法对患者的影响。逍遥丸是疏肝法的代表方之一，其疏肝解郁效果已得到临床验证，所以课题未设阳性对照药。同时，因MCI患者是痴呆的高危人群，确诊后应用安慰剂或不给予药物治疗伦理审查不予批准，故未设立安慰剂组或空白对照组，基于以上原因，本研究选择作用药前后的对照。且用药前知情同意中，已明确告知患者逍遥丸是用来改善肝郁而非认知功能，把安慰剂效应降到最低，因此未设对照组对本研究结果和结论的影响有限。
1 实验材料
1.1 实验量表
一般情况及病史调查表；简易精神状态检查量表(Mini-Mental State Examination， MMSE)；蒙特利尔认知评估量表(Montreal Cognitive Assessment， MoCA)；全面衰退量表(Global Deterioration Scale，GDS)；日常生活活动量表(Activity of Daily Living Scale，ADL)；肝气郁结证症状程度计分表；中国修订版韦氏成人智力量表(Wechsler Adut Intelligence Scale-Chinese Revised，WAIS-RC)。
1.2 实验试剂
人血浆超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)酶免试剂盒(美国R&D公司，批号14-11)；人血浆过氧化脂质(lipid Peroxide，LPO)酶免试剂盒(美国R&D公司，批号14-11)；人尿8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG)酶免试剂盒(美国R&D公司，批号14-11)。
1.3 主要仪器
SK30台式多功能高速冷冻离心机(美国Sigma公司)，全波长自动酶标仪(美国热电)，HPS-250生化培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)。
2 对象与方法
2.1 研究对象
来自2013年7月至2015年1月河南中医学院一附院、三附院体检科参加体检人员及郑州市莆田、贾岗、磨李等大型社区的志愿者，其中符合要求的患者共47例，2人因身体原因退出，实际参与本项研究者45人。本研究以自愿为前提，履行知情同意手续，并报河南中医药大学一附院伦理委员会批准。
2.2 纳入标准
①符合国际MCI工作组标准[6]；②神经心理学量表：MMSE得分：文盲>17分，小学>20 分，中学或以上>24分；MoCA得分<26分，若受教育年限≤12年则MoCA得分加1分以校正；GDS为2～3级；ADL得分<26分；③符合肝气郁结证症状筛选标准[7]：A.胸胁乳房少腹胀痛；B.抑郁太息；C.咽有梗阻感；D.痛经、闭经或月经先后不定期；E.脉弦。5项中A、B必备，具有3项或兼有如下1项脾虚症状(神疲体倦、纳差、腹胀、便溏)，记分在6分以上者。计分标准按症状分，胸胁乳房少腹胀痛、抑郁太息、痛经、月经不调、神疲体倦、纳差、腹胀7项均有5个等级：无(0分)、轻(1分)、中(2分)、重(3分)、严重(4分)；咽有梗阻感、便溏脉弦2项均有2个等级：无或消失(0分)、有(1分)；④年龄在40～65岁之间；⑤每例患者的MCI最终临床诊断和肝气郁结证诊断均由两位相应专业高级职称临床医师分别独立进行，均符合者方可纳入。
2.3 排除标准
不符合国际MCI工作组标准或肝气郁结证症状筛选标准者；不能配合调查及检测者；头部肿瘤；存在神经系统疾病；重要脏器病变可能影响脑功能或影响对认知功能的评价；精神疾病病史；活动性癫痫者；痴呆患者；服用影响认知功能药物者。
2.4 血尿样品的采集与制备
患者用药前后分别由河南中医药大学一附院体检中心采血、留尿样，以乙二胺四乙酸作为抗凝剂，血液混合抗凝剂后离心20 min(2000-3000 r/min)，收集上清液。尿样以同样方法离心处理。
2.5 8-OHdG、SOD和LPO的检测方法
采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)对尿8-OHdG、血浆SOD和LPO进行检测。按试剂盒说明逐级加入稀释过的标准品50 μL，加入样本50 μL，封板后置37 ℃生化培养箱中温育反应30 min，洗涤5次；每孔加入酶标试剂50 μL(空白孔除外)温育、洗涤；每孔加显色剂A、B液各50 μL，37 ℃避光温育15 min，每孔加50 μL终止液。轻轻混匀30 s，15 min内450 nm波长依序测量各孔吸光度并计算样品浓度。
2.6 药物干预
逍遥丸组成(河南省宛西制药股份有限公司，批号140409)：柴胡、当归、白芍、白术(炒)、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜，每次8粒，每日3次，持续用药3个月。
2.7 统计学方法
3 结果
3.1 肝气郁结证症状程度计分结果
表1显示，与用药前比较，患者用药后肝气郁结证症状程度计分降低，差异有统计学意义(P<0.05)。
表1 肝郁型MCI患者用药前后肝气郁结证症状程度计分比较分)
3.2 MoCA和WAIS-RC简式结果
表2显示，与用药前比较，患者用药后MoCA量表的视空间与执行、注意、语言、抽象、延迟回忆、定向及总分均有所提高，差异有统计学意义(P<0.05)；命名得分与用药前比较差异无统计学意义(P>0.05)。
表3显示，与用药前比较患者用药后WAIS-RC量表四合一简式的相似性、数字广度、填图、木块图及总分均升高，差异有统计学意义(P<0.05)。
表2 肝郁型 MCI患者用药前后MoCA结果分)
表3 肝郁型MCI患者用药前后WAIS-RC简式粗分比较(，分)
3.3 尿8-OHdG、血浆SOD和LPO检测结果
表4显示，与用药前比较 患者用药后的尿8-OHdG含量降低(P<0.05)，血浆SOD和LPO值比较差异无统计学意义(P>0.05)。
表4 肝郁型MCI患者用药前后尿8-OHdG、血浆SOD、血浆LPO结果
4 讨论
目前肝气郁结证症状计分尚无统一标准，本研究采用应用较广的肝气郁结证症状程度计分表对患者进行评测。结果显示，患者用药后的分值低于用药前，差异有统计学意义，说明疏肝法可以降低患者的肝气郁结程度。
MoCA是一个对认知功能异常进行快速筛查的评定工具。韦氏成人智力量表(Wechsler Adut Intelligence Scale，WAIS)是当今国际心理学界公认的较好的智力测验之一，但该量表内容较多，耗时较长，被试难以坚持，故有学者建议用WAIS简式量表[10]。本研究采用MoCA量表和WAIS-RC四合一简式对患者的认知功能进行评测。结果显示，患者用药后MoCA量表除命名外其余领域得分及总分均升高，WAIS-RC四合一简式的4项分测验粗分及合计粗分均提高，说明疏肝法可以改善患者的认知功能。
8-OHdG是公认的DNA氧化损伤标志物[11]。受内外源刺激后，8-OHdG 则作为代谢废物随尿液排出体外[12]。研究表明，8-OHdG在中晚期阿尔茨海默病(alzheimer disease，AD)和MCI患者的大脑中含量增高[13]；尿液中8-OHdG的水平与认知功能高低呈负相关[14]。本研究结果显示，与用药前比较，患者用药后尿8-OHdG含量降低，提示疏肝法可减轻肝郁MCI患者DNA的氧化损伤。本研究结果与张俊芳等报道的正常参考值有较大差异，所用检测仪器不同及被试日照时间等因素可能是造成上述差异的原因[8]，该差异不会对本文结论造成影响。
张铭湘等研究认为，神经性退行病变与自由基代谢失衡有关[15]。SOD作为一种抗氧化酶，其活性高低间接反映机体清除氧自由基的能力。SOD活性降低，氧自由基浓度就会升高，可引起神经细胞代谢紊乱、变性、坏死，进而导致患者认知功能损害[16]。多项研究显示，MCI患者的SOD活性低于正常对照[17-18]；MCI患者认知功能改善后，血清SOD活性随之升高[19]。但本研究中患者用药前后SOD水平未出现显着差异，可能的原因如下：一是运用疏肝法不能提高肝郁型MCI患者血浆SOD活性；二是因用药前后2次检测已相隔3个月，患者又处于自然衰老过程中，所以上述结果提示疏肝法的应用尚不能逆转自然衰老所致的SOD水平下降。
LPO是不饱和脂肪酸经自由基作用形成的过氧化物。随着年龄增长，人体清除自由基的能力下降，LPO生成增多导致生物体趋向衰老[20]。Lee LK等发现，与正常组比较MCI组的LPO水平显着升高[21]。花戎等运用增智灵口服液对痴呆患者和记忆障碍小鼠进行干预，发现用药后患者的社会功能以及小鼠的学习记忆能力均得到一定提升，而两者的LPO含量则显着降低[22]。但本研究中患者用药前后LPO无明显改变，原因可能是随着年龄增长，中老年人生成LPO增多，超过了疏肝法降低LPO的能力，也可能是疏肝法不具有直接清除LPO的作用。
肝郁可影响全身气机通调致脏腑受累，或气血亏虚、脑失濡养，或痰瘀互结、清窍阻塞，终可使脑之生机下降，引起MCI发生。故课题组提出“肝郁脑衰”假说，即旷日持久的情志不畅、疏泄失职是加速衰老进程中认知功能衰退的重要原因之一，并用逍遥丸对肝郁型MCI患者进行干预以反正该理论。逍遥丸方中柴胡、薄荷、生姜辛散以疏肝；当归、白芍养血以柔肝；炙甘草益气补中、缓肝之急；白术、茯苓补土健脾防肝之克。如此配伍既补肝体又助肝用，还可防肝之传变，能很好地发挥疏肝解郁之效。实验结果表明，疏肝法能改善肝郁型MCI患者的认知功能、降低DNA的氧化损伤是其可能的原因。上述研究结果从一定程度上反证了“肝郁脑衰”假说，为认知功能衰退的中医药干预提供了新思路，为肝主疏泄和七情内伤赋予了新认识，为中医衰老理论增添了新内涵。
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Effects of Soothing Liver Therapy on Cognitive Function, 8-OHdG in Urinary and Plasma SOD and LPO in MCI Patients with Liver Qi Stagnation Type
HOU Jun-lin, ZHAN Xiang-hong△, SUN Qian-ming, GUAN Xu-tao, LIU Yong, LIANG He, YAN Gou-li, LI Wei
(HenanUniversityoftraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450046,China)
Objective：To study the effect of Shugan method to liver depression degree，cognitive function，8-OHdG，SOD and LPO in MCI patients with liver qi stagnation. Methods： Use the International diagnostic criteria for MCI and symptoms of liver qi stagnation screening standard to screening 40 to 65 years old MCI patients with liver qi stagnation.Use degree of liver qi stagnation scores table to evaluate patients degree of liver qi stagnation.Use MoCA and WAIS-RC to evaluating patients cognitive function.Use ELISA to detect 8-OHdG，SOD and LPO in patients before and after treatment.Results： Compared with before treatment，after treatment in the patients, score of liver qi stagnation symptom reduced, score of visuospatial execution， attention， language， abstract，delayed recall，orientation and total score of MoCA Scale all increased.Score of name of MoCA Scale did not change significantly.Score of similarity，digit span，mapping，block diagram and total score of WAIS-RC all increased.The content of 8-OHdG decreased.The activity of SOD and the content of LPO had no significant change.Conclusion： Shugan method can reduce symptoms of liver qi stagnation in MCI patients with liver qi stagnation，improve patients cognitive function，reduce oxidative damage to DNA is the possible causes of the improve of patients cognitive function.
Shugan method; Liver qi stagnation; Cognitive function; Oxidation level
国家自然科学基金资助项目(81173148)-基于肝疏泄理论探讨情志对衰老进程中认知功能的影响及机制；国家自然科学基金资助项目(81473556)-疏肝法对情绪调节不良MCI患者工作记忆影响的机制研究；河南中医药大学博士科研基金项目(BSJJ2011-08)-孔圣枕中丹对MCI患者认知功能和ERP成分的影响
侯俊林(1981-)，男(蒙古族)，河南镇平人，讲师，医学博士，从事情志与衰老相关疾病的理论及临床研究。
△通讯作者：詹向红(1963-)，女，河南许昌人，教授，医学博士，博士研究生导师，从事情志与衰老相关疾病的理论及应用研究，Tel：0371-65962406，E-mail：zxh371@163.com。
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B
1006-3250(2017)08-1102-03
2016-07-26
