安致君，刘珍洪，于 峥，汪文来，陶旭光，高 蔚，郭 蓉，殷 茵， 韩雪珍，吴丹桐，赵凯维， ，赵红霞Δ，杨 桢Δ

(1. 北京中医药大学,北京 100029； 2. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700；3. 美国德克萨斯大学健康科学中心综合生物学及药理学系，休斯顿)

蛇床子最早收录于《神农本草经》，具有数千年的医疗实践应用，别名野茴香、野胡荽，为伞形科植物蛇床的干燥成熟果实，具有浓郁的芳香气息。其性味辛、苦、温，具有温肾壮阳、杀虫止痒的功效[1]，临床上用来治疗阴部瘙痒、痹症、湿疹、阳痿、宫寒不孕等。热敏通道(TRPV1、TRPA1和TRPM8等)是自然界许多芳香物质的分子靶点，它与温热感有关，也与瘙痒和疼痛密切相关。许多辛味中药如生姜(辛、微温)、吴茱萸(辛、苦，热)、葱白(辛、温)、羌活(辛、苦，温)等含有TRPV1的激动剂[2-3]，部分TRPV1/A1/M8的激动剂已经在蛇床子中存在。蛇床子部分药效的发挥可能是作用于热敏通道TRPV1路径实现的。本研究以蛇床子提取物(水提和醇提)为研究对象，结合电生理膜片钳技术，在瞬转了人TRPV1的HEK293细胞上测试其能否活化或抑制TRPV1，以探讨蛇床子发挥药效作用的分子靶点。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

中药蛇床子(北京同仁堂东四药店)，TRPV1 plasmid(Origene，RC217653)，质粒GFP(北京爱思益普)、DMEM cell culture medium、Fetal Bovine Serum、penicillin/streptomycin(Gibco)、Lipofectamine2000(invitrogen)、Capsaicin、DMSO、Sodium chloride、Potassium chloride、Cesium chloride、EGTA、HEPES、Magnesium chloride hexahydrate、D-glucose、Calciumchloride(Sigma)。

1.2 仪器

300克密封型摇摆式粉碎XL-06B(广州旭朗)、旋转蒸发器RE-52(上海虹昕)、数显恒温水浴锅HH-6(常州润华)、SHZIII型循环水真空泵(上海亚荣)、EPC-10 Quattro膜片钳放大器(Heka)、PatchMaster数据获取软件(Heka)、P-97拉制仪器(Sutter Instruments)、IGOR-Pro分析软件(WaveMetrics Inc)等。

1.3 实验步骤

1.3.1 蛇床子提取物制备 水提物制备：用电子秤量得50 g蛇床子，倒入400 ml双蒸水浸泡30 min，加热至沸腾30 min后倒出药汁，剩余的药渣加250 ml双蒸水第二次煎煮，合并2次药汁，双层滤纸过滤，99℃恒温水浴锅加热浓缩调浓度为1 g/ml，3500 r/min离心15 min后取上液即得蛇床子水提物，4℃冰箱中保存备用。

醇提物制备：秤量80 g蛇床子，粉碎后加入640 ml的75%乙醇浸泡30 min，转移入回流提取器中于95℃恒温水浴锅上回流提取2 h，收集药液过滤，剩余的药渣再倒入400 ml乙醇继续回流1 h，2次所提滤液倾入旋转蒸发器上回收乙醇，所得提取物(膏状物不含乙醇)用双蒸水调浓度至1 g(生药)/ml。以上提取物均分装后保存于-20℃低温冰箱备用。

1.3.2 电生理膜片钳实验 参照前期实验论文方法[3]

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 蛇床子水提物作用于hTRPV1/ HEK293效应研究

图1显示，蛇床子水提物稀释成5 mg(生药)/ml，测试其对表达hTRPV1/ HEK293细胞跨膜电流的作用。实验过程中，先滴入细胞外液作为阴性对照，观察电流的基线水平，然后滴加测试样品，电流到达峰值并开始下降后用细胞外液洗脱(washout)，最后施加阳性药30 μM辣椒素检验所记录细胞是否成功转染。结果显示，与正常细胞外液(Pre)比较，蛇床子水提物使hTRPV1/ HEK293细胞诱导产生明显的跨膜电流，蛇床子水提物滴加入空转的HEK293细胞中不产生跨膜电流(数据不显示)。

注： 左图：各组+100 mV电压下电流峰值对比统计图右图：+100 mV电压下跨膜电流时程图，其中小图为在细胞外液(a)、蛇床子提取物峰值(b)、辣椒素峰值(c)点用电压斜坡(voltage ramp)检测到的I-V关系曲线。**P<0.01，表示组间差异显着，n=6图1 蛇床子水提物作用于hTRPV1/ HEK293效应研究

2.2 蛇床子乙醇提取物量效研究

图2显示，将蛇床子醇提物给予细胞外液稀释成3 mg/ml和10 mg/ml，测试这2个浓度的蛇床子醇提物对表达hTRPV1的HEK293细胞跨膜电流的影响。结果显示，与正常细胞外液(Pre)比较，蛇床子醇提物3 mg/ml、10 mg/ml这2个浓度均可使细胞产生跨膜电流(P<0.01)，且3 mg/ml、10 mg/ml这2个浓度产生的跨膜电流无显着差异。

注：左图：各组+100 mV电压下电流峰值对比统计图右图：+100 mV电压下跨膜电流时程图** P<0.01，表示组间差异显着，n=6图2 蛇床子醇提物对转染hTRPV1的HEK293细胞全细胞电流影响

2.3 结论

蛇床子的水提物和醇提物都激活TRPV1通道产生跨膜电流。蛇床子的辛温之性很可能是TRPV1活化的结果，而TRPV1与瘙痒与疼痛的关系可以帮助我们很好地理解蛇床子的相关功效。

3 讨论

《神农本草经》将蛇床子列为上品，概述其性味功效：“味苦，平。主妇人阴中肿痛，男子阳痿、湿痒，除痹气，利关节，癫痫恶创(疮)。”其后不久的《本草经集注》(草木上品)记载为“味苦、辛、甘，平，无毒。主治妇人阴中肿痛，男子阴痿湿痒，除痹气，利关节，癫痫，恶疮。温中下气，令妇人子脏热，男子阴强。”《金匮要略·妇人杂病脉证并治》：“妇人阴寒，温中坐药，蛇床子散主之……绵裹内之，自然温。”《备急千金要方·杂治第十七》曰：“治产后阴下脱方：蛇床子一升，布裹炙熨之。亦治产后阴中痛。”又有外治方：“治男女阴中疮湿痒方(黄连、栀子、甘草、黄柏、蛇床子)……为细末，以粉疮上……深者，用绵裹纳疮中。”现代《中药学》将其应用概括为：“阴部湿痒，湿疹，疥癣；寒湿带下，湿痹腰痛；肾虚阳痿，宫冷不孕”，既可内服又可外用。现代研究[4-5]显示，蛇床子具有抗菌、止痒、止痛、防治骨质疏松、保护心血管、抗血栓、镇静催眠等作用。

从分子方面理解蛇床子的功效有重要意义。近来，随着热敏通道的发现以及部分结构和作用的揭示，使得对蛇床子的部分功效和主治可以得到进一步的理解。热敏通道是感受寒热的一类生命攸关的蛋白质，在机械和热传导、皮肤稳态、味觉、肾、内分泌、呼吸道、免疫、心血管、中枢神经系统、生育和衰老方面都发挥作用。它们大量的分布在外周感觉神经上，以感知内外环境的温度、化学、机械等伤害性刺激，与寒热、疼痛和瘙痒等感觉有着重要关联[6]。

3.1 蛇床子的化学成分

蛇床子的化学成分主要有香豆素类和挥发油类以及其他微量元素[4]，而具有生物活性的香豆素类化合物含量最高[7]。蛇床子所含欧前胡素(imperatorin)、蛇床子素(osthole)是TRPV1的激动剂[8-9]，其挥发油所含成分柠檬烯能激活另一个热敏通道TRPA1[10]。

3.2 蛇床子的温热感与止痛作用

外周神经调节阴道的平滑肌张力、血流量和疼痛敏感性，而子宫表达TRPV1、TRPA1的神经随着性激素水平的生理波动，如怀孕、分娩、性周期和青春期时产生巨大改变，局部性激素也参与其间[11-12]。这些部位的疼痛与局部神经重塑有关，外阴痛的特征是在外阴前庭区域有痛苦的烧灼感，异常性疼痛和痛觉过敏，局部上皮内和乳突的神经支配，其间的TRPV1表达大量增加[13]。

蛇床子对外阴和盆腔的疼痛均有良好效果，蛇床子的全身或局部运用会活化TRPV1受体产生温热感，这应该是蛇床子外用“绵裹内之，自然温”的分子基础，如同辣椒或大蒜。阴道内使用蛇床子除产生温热感对宫寒发挥治疗作用外，还会由TRPV1/TRPA1介导，通过神经交叉脱敏对多种因素如膀胱炎、前列腺炎、结肠炎或腰肌劳损等引起的盆腔疼痛发挥止痛作用[14]。动物行为学实验也证明，蛇床子素能够显着减少醋酸致痛小鼠的扭体次数和升高热致痛小鼠的痛阈，对物理和化学引起的疼痛和炎症均有明显的对抗作用[4]。

3.3 蛇床子的止痒作用

瘙痒和疼痛是密切相关但截然不同的感觉，其源头均在感觉神经的皮肤末梢，它们共享大部分重叠的介质和受体，瘙痒反应的神经元对疼痛刺激也很敏感，瘙痒的复杂机制目前并不清楚。疼痛刺激可引起一些慢性病(如特应性皮炎)的瘙痒，一些治疗慢性疼痛的药物对慢性瘙痒也有效，TRPV1的活化对瘙痒通道有抑制作用[15]。实验证明，适当浓度的蛇床子素可通过调控TRPV1离子通道的活性抑制组胺依赖性痒[8]。

3.4 蛇床子的其他作用

古人用蛇床子治疗癫痫。长期以来，认为海马神经元中的钙离子累积是癫痫的主要发病因素。TRPV1是海马中钙透性通道和癫痫的介质，TRPV1在癫痫脑区如海马CA1区和齿状回中表达，表明在海马体中抑制TRPV1可能是一个预防癫痫发作的靶点[16]。因此，依古籍记载蛇床子可能会作用于大脑，这需要证实其有效成分可以穿过血脑屏障。蛇床子素通过血脑屏障的证据是确定的[17]。蛇床子的抗癫痫作用可能不是以TRPV1为惟一作用靶点，其所含总香豆素可以作用于GABAA受体[18]，该受体在癫痫发作中有重要意义。而这二者之间，TRPV1的活性可以被GABA受体抑制[19]，可能有助于抑制癫痫的发作。可见，蛇床子抗癫痫在同一信号通路中的作用是多靶点的。

蛇床子对神经系统的影响还包括改善学习记忆、抗帕金森、镇静催眠等作用[17]，对于蛇床子的研究显示出有性激素样作用。性激素在不同的感觉细胞中发挥多效性作用，促进神经系统的再生具有重要的功能。性激素的减少与认知和心理健康受损以及神经病变性疾病的风险增加有关，恢复神经-内分泌轴的关键在于老化过程中可通过神经保护和神经再生在部分区域，雌激素依赖性瞬时受体电位阳离子通道TRPV1，能够介导神经保护、神经生成以及受损神经再生，TRPV1激动剂可调节被敏化神经元的神经保护与修复[20]，而调节剂作为其他认知增强剂，可提高神经干细胞祖细胞在神经网络中的存活率、分化和整合能力[21]。

精子生成依赖睾丸的酸性微环境，Sertoli细胞为调控和维持精子发生提供了一个受控的微环境，其中酸性环境对男性生育力至关重要。它是由酸敏氯离子通道(ASCC)调节，而TRPV1是其调控因子[21]。精子运动到受精地点是一个复杂过程，这与精子有趋热性有关，即精子具有温度导向的运动，这样才能与卵子结合而受孕。热敏通道TRPV1是温度传感器，是精子趋热运动的介质[22]。这些研究对蛇床子在阴道的使用、产生温热感及治疗宫寒不孕有重要意义。

蛇床子性温味辛，是自然界的香草，有典型的热敏通道配体的特征。本研究证实了这一点，并部分阐明了该药的分子意义。