津力达颗粒对PCOS模型大鼠卵巢TGF-β/CTGF的影响❋

邵 飞，沈山梅，刘佳怡，张冰洁，乔程程，李忆昆，杨家苗，燕 歌，毕 艳，朱大龙

(1.南京中医药大学中西医结合鼓楼临床医学院,南京 210008；2. 南京大学医学院附属鼓楼医院内分泌科,南京 210008)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是较常见的引起育龄妇女内分泌紊乱的疾病，累及5%～10%的育龄妇女[1]。我国育龄期妇女的患病率约为5.6%[2]。PCOS的特点是排卵功能障碍和雄激素过多，其主要临床表现为月经不调、多毛症、痤疮、脱发和不孕症等[3]。但PCOS发病机制至今尚未完全明确，胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)及其代偿表现高胰岛素血症(hyperinsulinism，HI)在PCOS的发生发展中起重要作用[4]，慢性炎症、卵巢间质纤维化也与PCOS发病有着密切关系[5]。卵泡细胞间隙增大，间质胶原纤维增多是引起PCOS患者卵泡发育的重要生理病理原因之一[6]。转化生长因子(transforming growth factor-beta TGF-β1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)能够促进卵巢纤维化，导致卵巢功能下降[7]。本实验旨在探讨津力达颗粒对模型大鼠卵巢TGF-β1、CTGF表达的改变，以期为津力达颗粒治疗PCOS提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及饲料

50只体质量为40～50 g清洁级21 d龄雌性SD大鼠，购买于南京医科大学动物繁殖中心，饲养于南京鼓楼医院动物实验中心，实验室温度(23±2)℃，相对湿度40%～60%，光照时间每天9∶00～21∶00，常规饲料喂养，自由摄食饮水。动物垫料及饲料均由南京鼓楼医院动物实验中心提供。

1.2 药物及试剂

注射用脱氢表雄酮(购自武汉华美华科技(集团)有限公司上海分公司)；二甲双胍(购自中美上海施贵宝制药有限公司)；注射用油剂(购自安徽宇博化工有限公司)；津力达颗粒(购自石家庄以岭药业股份有限公司)；SYBR green(购自美国ABI生物公司)；GAPDH、TGF-β1、CTGF兔抗鼠源性一抗(购自Santa CRUZshen生物公司)；辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(购自武汉博士生物科技公司)；PCR引物(北京奥科生物有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型建立 SD大鼠常规适应性喂养7 d，随机取40只，于颈背部皮下注射DHEA(6 mg/100 g)+ 注射用油剂(0.2 mL)，连续20 d。20 d后在光学显微镜下观察大鼠的阴道涂片，连续4 d，即大鼠的1个动情周期。观察到大鼠阴道上皮持续角化，失去动情周期则造模成功，否则为造模失败应予剔除。同时模型组随机处死4只大鼠，行卵巢HE染色，以进一步证实造模结果。

1.3.2 动物分组及给药 造模第21天后给药，将成模大鼠按随机数字表法分为模型组、津力达组、二甲双胍组及津力达+二甲双胍组。药物干预组给予相对应药物灌胃：二甲双胍0.265 g/(kg·d)以265 mg/mL溶于生理盐水中；津力达颗粒 50 mg/(kg·d)以10 mg/mL溶于生理盐水中，每日1次灌胃，连续28 d(约7个大鼠动情周期)。空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续28 d。模型组及各药物干预组持续皮下注射DHEA，以防止其自身恢复排卵。

1.3.3 血清中TGF-β1、CTGF水平测定 腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，下腔静脉取血4～5 mL，以3000 r/min离心10 min，留取上清。酶联免疫吸附试验(ELASA法)检测血清中TGF-β1、CTGF、INS，最低检测浓度分别为<0.1 ng/mL、<0.1 ng/mL、<0.1 mU/L。各指标板内、板间变异系数均小于15%。取出反应板，依次加入标本、标准品、辣根过氧化物酶标记的检测抗体，经过温浴并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度。

1.3.4 蛋白质印迹法(Western Blot)检测卵巢TGF-β1、CTGF蛋白表达 将冰冻的卵巢组织解冻并称量重量，加入组织裂解液提取蛋白。取30ug蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法将蛋白转移至聚偏氟乙烯模，5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，加入1∶2000稀释的GAPDH抗体、TGF-β1抗体、CTGF抗体，4 ℃过夜。第2天洗膜后加入1∶5000稀释二抗，室温孵育1 h再次洗膜，最后采用化学发光试剂盒暗室显影。

1.3.5 qRT-PCR检测卵巢TGF-β1、CTGF mRNA表达 Trizol法提取卵巢组织总RNA，逆转录制备cDNA, qRT-PCR采用Syber Green I GoTaq qPCR Master Mix试剂盒，检测卵巢TGF-β1、CTGF mRNA表达, 以GAPDH基因为内参。TGF-β1 Forward 5’-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG- 3’，Reverse 5’-TGGGACTGATCCCATTGATT- 3’；CTGF Forward 5’-GGGCCTCTTCTGCGATTC-3’， Reverse 5’- ATCCAGGCAAGTCAGGTA- 3’；GAPDH Forward 5’-TGGATTTGGACGCATTGGTC- 3’，Reverse 5’- TTTGCACTGGTACGTGTTGAT- 3’。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 SD大鼠造模结果评估

图1显示，空白组模型大鼠阴道涂片可见大量核上皮细胞、角化上皮以及白细胞，提示空白组大鼠存在动情周期变化；模型组大鼠阴道涂片仅见大量白细胞，提示模型组大鼠失去动情周期变化。空白组大鼠卵巢HE染色未见卵巢多囊样变，可见卵母细胞及其周围原始卵泡，以及不同发育阶段的卵泡及多个黄体，颗粒细胞呈多层，形态完整，排列整齐。其余各组大鼠卵巢HE染色，见卵巢呈多囊样改变，卵泡体积增大，闭锁卵泡增多，颗粒层细胞减少，卵泡细胞之间间隙增大。本实验中SD大鼠均造模成功。

2.2 各组血清TGF-β1、CTGF水平

表1显示，模型组TGF-β1、CTGF水平较空白组显着升高(P<0.01)，各治疗组TGF-β1水平较模型组均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，二甲双胍组血清CTGF较模型组降低(P<0.05)；津力达+二甲双胍组血清CTGF较模型组显着降低(P<0.01)。

表1 各组TGF-β1、CTGF血清学结果比较

注：正常对照组比较：△P<0.01；与模型组比较：#P<0.05

2.3 各组卵巢TGF-β1、CTGF蛋白表达及mRNA水平

图2表2显示，模型组TGF-β1、CTGF蛋白表达及mRNA水平较空白组增高(P<0.05)；二甲双胍组、津力达+二甲双胍组卵巢TGF-β1、CTGF蛋白表达及mRNA水平低于模型组(P<0.05)；津力达组卵巢TGF-β1蛋白表达低于模型组(P<0.05)，在TGF-β1、CTGF mRNA水平低于模型组(P<0.05)。

注：1：空白组；2：模型组；3：津力达组；4：二甲双胍组；5：津力达+二甲双胍组图2 各组大鼠卵巢组织中TGF-β1、CTGF表达比较

表2 各组TGF-β1、CTGF蛋白及mRNA表达结果比较

注：正常对照组比较:△P<0.01；与模型组比较:#P<0.05

3 讨论

PCOS的发病机制目前尚不明确，与遗传及环境因素密切相关，涉及神经内分泌及免疫系统的复杂调控网络[8]。近年研究表明，卵巢纤维化是多囊卵巢因素的发病机制之一，主要引起卵巢结构破坏和功能紊乱[9]。卵巢纤维化可由不同因素引起，如手术、炎症以及免疫异常。在组织修复期间，细胞因子如TGF-β1、CTGF等相互作用促进ECM沉积，最终引起卵巢纤维化的发生发展。Wang等研究发现，在DHEA诱导的大鼠卵巢中，纤维蛋白和胶原蛋白具有更高的水平，而主要纤维化标志物如TGF-β1、CTGF明显上调[6]。本研究结果提示，在造模结束后模型组大鼠阴道上皮持续角化，失去动情周期；同时HE染色镜下可见卵巢多囊样变,卵泡腔增大，白膜明显增厚，闭锁卵泡增多，颗粒细胞层减少；卵巢组织蛋白水平提示模型组TGF-β1、CTGF显着高于空白组，提示PCOS模型制造成功。

中医学认为，PCOS发病三脏功能失调及痰湿、瘀血、内热等多种病理因素有关。PCOS患者卵巢在病变初期表现为脾虚湿盛，脾失健运，水湿内停，聚湿成痰，久则湿热内蕴、湿热交阻、灼津为痰；病至后期，则内生痰浊、痰瘀互结、郁阻血脉、胶固难除。肝脾肾功能不全以及痰、瘀、湿等停聚于卵巢可引起卵巢增大、卵泡发育不全以及局部炎症因子增多引起卵泡细胞间隙增大、间质胶原纤维增生等变化。津力达颗粒由人参、黄精、麸炒苍术、苦参、麦冬、地黄、制何首乌、山茱萸、茯苓、佩兰、黄连、知母、炙淫羊藿、丹参、粉葛、荔枝核、地骨皮等17味中药组成，以益气养阴、健脾运津兼以补肾活血祛瘀。痰、瘀、湿等病理因素改善，一定程度可改善卵巢病理变化。本研究中，模型组TGF-β1、CTGF水平在血清学水平、蛋白及mRNA水平要明显高于空白组。TGF-β1水平异常升高可引起卵泡发育不良和排卵障碍[9]。Lee等研究表明，TGF-β1表达的降低可防止DHEA诱导的高雄激素状态[12]。CTGF是目前所发现的与PCOS相关且较为重要的生长因子之一。既往研究发现，CTGF在PCOS模型大鼠中的卵巢颗粒细胞中高表达[13]。国内学者证实，CTGF在PCOS模型大鼠中高表达，同时发现抑制CTGF的表达可通过PI3K/AKT通路降低颗粒细胞增殖并诱导其凋亡[14]，以及促进组织修复功能和恢复正常结构功能。CTGF是TGF-β1的下游反应元件，与TGF-β1相似的生物学功能，具有促进细胞增殖，增强细胞的表达黏附分子，促进胶原蛋白合成和特定细胞分泌ECM[15-16]。TGF-β1和CTGF之间的相互作用调节组织纤维化的发展和进展[17]。TGF-β1诱导的CTGF进一步作用于间充质成纤维细胞，通过旁分泌机制反过来刺激TGF-β1的分泌。纤维发生时发生，过表达TGF-β1上调表达其下游反应元件CTGF和刺激物ECM的生产，二者相互影响并进一步促进胶原蛋白生成的增加并加速发展。阻断TGF-β1可抑制TGF-β1信号通路，阻止纤维化的发展。本实验结果表明，津力达颗粒干预后大鼠血清TGF-β1及CTGF有降低趋势，与二甲双胍联用二者降低趋势更加明显。卵巢组织蛋白及mRNA水平也提示，津力达颗粒能够降低TGF-β1、CTGF表达，与单用二甲双胍组比较差异无统计学意义，而与二甲双胍联用后可显着降低TGF-β1、CTGF水平。

综上所述，DHEA诱导的PCOS模型大鼠经津力颗粒达干预后TGF-β1、CTGF水平明显下降，提示津力达对PCOS的卵巢纤维化有一定预防和改善作用，其机制可能是通过调节卵巢组织中TGF-β1、CTGF的表达水平。