骆小娟，张照庆，尹 晶，徐 芸，段轶轩，夏 杨，居诗如
(武汉大学附属同仁医院(武汉市第三医院)康复科，武汉 430061)
第三腰椎横突综合征是由于急性损伤或慢性劳损，使局部发生炎性肿胀、充血渗出等病理变化的疾病，临床多采用保守治疗。内热针是一种新型的针刺疗法，结合现代电子技术和工艺材料技术的改造，可通过内部加热传导热能，并具有温度可控、热能集中的特点，在治疗软组织损伤疾病中疗效显着[1-2]。急性损伤和慢性劳伤所致的第三腰椎横突综合征，会使损伤局部发生炎性肿胀，产生无菌炎症反应[3]。有研究表明，内热针能够减轻损伤组织的无菌性炎症[4]。因此，本研究拟通过构建第三腰椎横突综合征模型大鼠，探讨内热针治疗对第三腰椎横突综合征大鼠损伤组织炎症反应的影响及可能的分子机制。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
明胶海绵(0.5 cm×0.5 cm)，由南京金陵药业公司生产；罗哌卡因(批准文号H20020248)，由AstraZeneca AB公司生产；得宝松(批准文号H20130187)，由Schering-Plough Labo N.V.公司生产；甲钴胺(批准文号国药准字H20030812)，由卫材(中国)药业有限公司生产；兔抗人NF-κB p65单克隆抗体(货号#8242)、兔抗人Phospho-Akt (Ser473)、单克隆抗体(货号# 4060S)、兔抗人GAPDH单克隆抗体(货号#5174)均购自美国Cell Signaling Technology公司；大鼠白介素6(IL-6)ELISA试剂盒(货号RA20607)、大鼠白介素8(IL-8)ELISA试剂盒(货号RA20553)、大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒(货号RA20035)、大鼠白介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒(货号RA20020)均由Bio-swamp公司提供；内热针治疗仪(型号K，内热针总长10 cm，针柄长4 cm，针体长6 cm，针体产热长度6 cm)由济南佳科医疗科技有限公司生产；低温高速离心机(型号K3，美国Thermo公司生产)；全自动数码凝胶图像分析仪由上海天能科技有限公司生产。
1.2 动物及分组
无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雄性SD大鼠90只，体质量300～350 g，鼠龄3个月左右，购买于湖北省动物实验中心(动物合格证编号SCXK(鄂)2015-0018)。同一条件下适应性喂养1周后，将SD大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、药物组、内热针组、普通针刺组和温针灸组6组各15只。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。
1.3 第三腰椎横突综合征模型制备
第三腰椎横突综合征模型制备方法参照王健瑞等[5]造模方法，操作如下：按照3 mL/kg体质量使用10%水合氯醛对大鼠进行麻醉，俯卧位固定四肢，腰背部局部剪毛备皮，医用酒精擦拭消毒，取大鼠腰背部L3-L4棘突旁约0.6 cm处，纵向切口2 cm，由浅入深地向两侧剥离骸棘肌，显露第三腰椎横突，用微型骨科器械缓慢剥离第三腰椎横突周围组织(操作要仔细，避免伤及腰部神经)，完整分离腰椎深筋膜脊神经后支穿出部分，将0.5×0.5 cm大小的明胶海绵置于L3横突处，缝合骶棘肌筋膜和皮肤切口，使用庆大霉素注射液(7.5 mg/kg)反复冲洗切口防止感染。模型组、药物组、内热针组、普通针刺组和温针灸组大鼠均采用此法制备第三腰椎横突综合征模型，对照组大鼠不做任何处理。
1.4 分组治疗
造模2周后对各组大鼠进行分组治疗。正常组不做任何处理；模型组不接受治疗但进行常规麻醉；药物组混合药物由得宝松(0.6 mg/kg)+甲钴胺(0.1 mg/kg)+罗哌卡因(0.9 mg/kg)组成，常规麻醉后定点注射至第三腰椎损伤位置，每3 d 1次，每周2次共4周；内热针组常规麻醉固定，腰部皮肤消毒，用10 cm长的内热针从第三腰椎平行的方向刺入损伤组织内2 cm，43 ℃恒温加热20 min，每周1次共4周；普通针刺组常规麻醉固定，腰部皮肤消毒，用0.35 mm×40 mm毫针对第三腰椎平行肌损伤组织进行治疗，穿刺方法与内热针一致，每周1次共4周；温针组取穴、进针操作同普通针刺组，将艾条套入针尾点燃，至艾灸燃尽为止，每周1次共4周。
1.5 血清炎性细胞因子检测
治疗周期结束后麻醉固定大鼠，从锁骨中间位置进针采取大鼠颈静脉取血4 mL，加入0.2 mL抗凝剂EDTA·Na2混匀，静置30 min，3500 r/min，离心15 min取上清待检。采用ELISA法检测大鼠血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的含量，实验操作严格按照产品说明书执行。
1.6 HE染色
取血后采用断颈法处死各组大鼠，取第三腰椎横突造模处肌肉组织(正常组取相应部位肌肉)，经过4%福尔马林固定，乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚度4 μm，65 ℃烤片。将组织切片常规脱蜡至水，苏木精液染色，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下拍照观察组织病理学变化。
1.7 Western blot检测
取各组大鼠第三腰椎横突造模处肌肉组织(正常组取相应部位肌肉)，加入液氮磨碎，添加RIPA裂解液提取组织蛋白，采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取25μg蛋白进行10% SDS-PAGE，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜(PVDF)上，5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入一抗p-Akt(S473)(1∶1000)、NF-κB(p65)(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)后4 ℃孵育过夜，洗涤后滴加HRP标记的二抗山羊抗兔IgG(1∶10000)室温孵育30 min，洗涤后ECL化学发光液孵育1 min，使用全自动数码凝胶图像分析系统拍照观察。
1.8 统计学方法
2 结果
2.1 内热针治疗对损伤组织病理学的影响
图1 治疗后各组大鼠第三腰椎横突处肌肉组织HE染色(200×)
注：与正常组比较：###P<0.001；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01，*** P<0.001图2 各组大鼠血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平比较
图1示，正常组大鼠第三腰椎横突处肌肉组织结构正常，肌纤维排列整齐，未见炎性细胞浸润；模型组可见肌纤维断裂、排布混乱，且有大量组织坏死和少量炎性细胞浸润；内热针组与药物组肌纤维排列整齐，偶见炎性细胞；普通针刺组肌纤维排列松散，有少量炎性细胞浸润和组织坏死；温针灸组肌纤维排列不规则，有部分细胞坏死和少量炎性细胞浸润。
2.2 内热针治疗对炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8含量的影响
图2示，与正常组比较，模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8含量均显着升高(P<0.001)；与模型组比较，药物组、内热针组、温针灸组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8含量均显着降低(P<0.05)，普通针刺组大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-8含量均显着降低(P<0.05)，且内热针组最为显着(P<0.01)。
2.3 内热针治疗对大鼠损伤组织中p-Akt(S473)和NF-κB(p65)蛋白表达的影响
图3示，与正常组比较，模型组损伤组织中p-Akt(S473)和NF-κB(p65)蛋白均出现高表达(P<0.001)；与模型组比较，各治疗组p-Akt(S473)和NF-κB(p65)蛋白表达则出现下调(P<0.05)，且内热针组下调最为明显(P<0.001)。
注：与正常组比较：###P<0.001；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01，*** P<0.001图3 Western blot 检测损伤组织中p-Akt(S473)和NF-κB(p65)蛋白表达水平
3 讨论
第三腰椎横突综合征属于中医学“痹证”范畴，主要是因腰部劳损、筋膜增厚、黏连对腰脊神经后外侧支产生卡压，导致腰、臀部酸痛及腰部活动受限，是临床引起腰腿痛的常见病因之一。临床行X线检查一般不会发现异常，且偏向于保守治疗。有研究表明[6]，第三腰椎横突综合征损伤组织产生的炎症会导致以白细胞、巨噬细胞和活化的小胶质细胞为主的细胞渗出，以及血管通透性的增加，促炎因子的释放。组织中的巨噬细胞、中性粒细胞或活化的小胶质细胞渗出后，将聚集到炎症部位并释放TNF-α、IL-6、IL-1β、组胺和TGF-β等活性介质，进一步加重局部组织的损伤作用[7]。因此，第三腰椎横突综合征又称腰三横突周围炎或腰三横突滑膜炎。
实践已证实，内热针在腰突症、腰椎管狭窄、顽固性腰腿疼、各型颈椎病、肩周炎等软组织损伤疾病的治疗中疗效显着[8-9]。有研究称，内热针针体温度较集中，能够迅速传递到周围的肌肉及软组织中，从而促进局部血液循环，降低肌肉张力，具有减轻无菌性炎症的作用[4]。李晓泓等[10]采用明胶海绵植入法建立第三腰椎横突综合征后也发现，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎性细胞因子含量的显着升高。本研究结果也显示，第三腰椎横突综合征模型大鼠血清中促炎因子含量升高，且损伤组织中炎症反应严重，而通过内热针、普通针刺、温针灸和药物治疗后，大鼠血清中炎性细胞因子水平下降，组织损伤得到修复，说明针刺或针灸治疗能有效改善第三腰椎横突综合征的炎症反应，而内热针凭借其独特的工艺设计达到了最好的治疗效果。
有研究表明[11-12]，磷酸化的Akt能够激活IκB激酶，使IκB与NF-κB解离，形成具有活性的NF-κB p65亚基，使其进入细胞核，促进相关炎症因子的转录，进而导致炎症的发生。因此，推测内热针治疗改善第三腰椎横突综合征炎症反应的机制可能是通过抑制Akt/NF-κB信号通路实现的。本研究结果提示，Akt/NF-κB信号通路在第三腰椎横突综合征模型中处于激活状态。而经过治疗后，p-Akt(S473)、NF-κB(p65)蛋白则出现下调，说明内热针治疗抑制了Akt/NF-κB信号通路的激活。综上所述，内热针治疗可通过抑制Akt/NF-κB信号通路的激活，改善第三腰椎横突综合征的炎症反应。
