庞 延，卢健棋△，朱智德，王庆高，温志浩，梁逸强，林 浩，唐梅玲，许志亮
(1. 广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023； 2. 广西中医药大学，南宁 530000)
据报告显示，中国心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)死亡率已赶超肿瘤等其他疾病居于榜首，尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)在CVD中死亡率最高[1]。虽然目前经皮冠状动脉腔内成形术等技术得到快速发展，AMI死亡率有所下降，但AMI后恶性心律失常仍然是引起死亡的重要因素。研究提示[2]，接近90%的AMI有不同程度的心律失常，且发现约有32%的患者出现室性心律失常，其中室性心动过速(ventricular tachycardia, VT)约占75%。转录因子CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPs)是脂肪细胞分化中的重要转录因子，E6AP (E6 assiociated Protein)是细胞编码的一种泛素蛋白连接酶。Pooja Pal等团队[3]研究首次证实，E6AP能够通过降低C/EBPα的转录水平抑制心肌脂肪化，从而降低AMI后VT发生。西药在AMI后VT预防及终止疗效得到肯定，但因其副作用等因素在临床应用上仍存在一定的顾虑与限制。中医药治疗具有多靶点、副作用小等特点。既往研究表明，稳心颗粒联合西药治疗能够降低AMI患者血脂水平和降低室性期前收缩、非持续性室性心动过速等室性心律失常发生率，优于单用西药治疗[4]。本研究通过观察稳心颗粒对心肌梗死模型大鼠心肌脂肪化及E6AP、C/EBPα表达影响，探讨稳心颗粒对心肌脂肪化作用机制，以期为稳心颗粒在预防和降低AMI后VT发生提供一定的科学依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级健康雄性SD大鼠12只，1～3 d龄，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，实验动物许可证：SCXK(沪)2013-0016。
1.2 主要药物、试剂和仪器
稳心颗粒(山东步长制药股份有限公司，国药准字Z10950026，药物组成：党参、黄精、三七、琥珀、甘松)；胺碘酮(杭州赛诺菲民生健康药业有限公司，国药准字H33020581 产品规格0.2 g，批准日期2018-04-16)；戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司，货号H31020502)；牛血清白蛋白(Solarbio，货号A8020)；胶原酶I(Gbico，货号17100-017)；FBS(Gbico，货号10099148)；高糖DMEM/F12液体培养基(Gbico，货号C11330500BT)；胰酶(Solarbio，货号T1350)；牛胰岛素(上海源叶生物科技有限公司，货号11070-73-8)；E6AP一抗(santa cruz,sc-166689)；C/EBPα一抗(santa cruz,sc-365318)；鼠二抗(抗E6AP)(Jackson，315-035-003)；鼠二抗(抗C/EBPα)(赛默飞，62-6820)；DLK蛋白一抗(Santa Cruz Biotechnology，货号sc-376755)；荧光二抗：Goat anti-Mouse IgG (H+L)(molecular probes，货号Catalog #A-21206)；Trizol(Takara，Cat：9109)SYBR Green mix(诺维赞，Cat：Q111-01)；E6AP过表达和干扰腺病毒NC浓缩液、腺病毒OE初液、腺病毒Ube3a-3#初液均由上海锐赛生物技术有限公司提供；二氧化碳细胞培养箱(Thermo Scientific，型号Midi40)；共聚焦显微镜(厂家ZEISS，型号LSM710)；荧光定量PCR仪(Bio-Rad,型号:575BR)；双垂直电泳仪(北京六一，型号DYCZ-25D)，半干转膜仪(Bio-Rad,型号Yrdimes+ELITE200)。
2 方法
2.1 大鼠前脂肪细胞的原代分离及培养
无菌状态下取1～3 d龄雄性SD健康大鼠，经戊巴比妥钠麻醉，取大鼠颈、背部的皮下脂肪组织剪成小块，加消化液(DMEM/F12 +20 g/L牛血清白蛋白，临用时加1 g/L的胶原酶I)37 ℃消化30～50 min，过筛并收集滤液至离心管离心弃上清，加入DMEM/F12培养液清洗再离心然后加含10% FBS的DMEM/F12吹打混匀，制成单细胞悬液，即获得大鼠前体脂肪细胞。采用的前脂肪细胞基础培养基含10 ml FBS、89 ml高糖DMEM/F12 液体培养基、1 ml青链霉素混合液，一定条件下培养2～3 d换液1次。细胞贴壁呈梭形、透亮，胞质内无脂滴，长满80%时进行传代，二氧化碳培养箱中培养。
2.2 大鼠心肌细胞的原代分离及培养
无菌状态下取1～3 d龄SD健康雄性大鼠，经戊巴比妥钠麻醉后迅速开胸取出心脏，置于4 ℃二氮嗪强化Celsior液中保存。剪去除主动脉的一切血管及脂肪，将心脏迅速悬吊在灌流装置上，循环灌洗心脏3次，待心肌软化剪下心室肌组织，在酶液里浸泡切成碎片，置入离心管内振荡10 min 37 ℃，用尼龙网过滤去上清液，加入酶液继续离心振摇，直到心肌组织充分消化获取心肌细胞，二氧化碳培养箱中培养。
2.3 病毒转染
细胞密度达到30%进行感染，感染前弃去原培养基，加入新鲜的培养基，再分别加腺病毒NC浓缩液(10 μl)、腺病毒OE初液(100 μl)、腺病毒Ube3a-3#初液(100 μl)混匀，放入CO2培养箱中，感染8 h/过夜进行换液，在孔板中加入新鲜的完全培养基，感染24 h观察荧光，感染48 h/72 h使荧光率达到50%以上，持续培养使细胞密度融合到100%进行诱导，诱导2 d后重复1次，再继续培养4 d。
2.4 分组及前脂肪细胞诱导分化
无药血清组(空白组)给予大鼠MI后的无药血清；E6AP腺病毒组给予E6AP腺病毒转染的大鼠MI后的无药血清；E6AP封闭组采用RNAi技术封闭E6AP，给予MI后的无药血清；E6AP过表达组采用转染野生型E6AP，使其过表达并给予MI后的无药血清；胺碘酮组给予MI后的含胺碘酮血清10%;稳心颗粒组给予MI后的含稳心颗粒血清10%。各组置于10%FBS的高糖DMEM培养基中，并与同来源的小鼠心肌细胞共培养，各组均加细胞诱导分化培养基Ⅰ(含10 ml FBS、89 ml DMEM/F12液体培养基、1 ml青链霉素混合液、牛胰岛素1 mg/L、IBM×0.5 mmol/L、DE×1.0 μmol/L)，2 d后换成诱导分化培养基Ⅱ(含10 ml FBS、89 ml DMEM/F12 液体培养基、1 ml青链霉素混合液、牛胰岛素1 mg/L)，继续培养2 d，随后换为基础培养基，1～2 d换液1次，继续培养4 d。
2.5 油红O染色
弃去培养液，10%甲醛PBS固定，0.35%油红O母液(含0.35 g油红、100 ml异丙醇)与去离子水3∶2混合，滤纸过滤，静置数分钟，取上层液对细胞进行染色10 min，去离子水冲洗后显微镜下观察并拍照。
2.6 荧光定量(PCR)检测C/EBPα、E6AP的mRNA 表达
提取总RNA，扩增mRNA，再逆转录为 cDNA，荧光定量 PCR 法检测C/EBPα、E6AP mRNA表达。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：E6AP：上游AGGGGACGTGGACACAAATC，下游TGGATCCACTCGAGGACCTT，片段长度：127 bp；C/EBPα：上游GTCGGTGGATAAGAACAGCAACG，下游AGGCGGTCATTGTCACTGGTC，片段长度：144 bp；Atcb(内参)：上游GCTATGTTGCCCTAGACTTCGA，下游GATGCCACAGGATTCCATACC，片段长度：173 bp。采用2-△△Ct法进行各基因表达的相对定量。
2.7 统计学方法
3 结果
3.1 各组前脂肪细胞C/EBPα、E6AP的mRNA表达结果
表1示，E6AP过表达组E6AP表达明显高于各组，除E6AP过表达组以外，稳心颗粒组E6AP表达明显高于各组(P<0.05)，胺碘酮组E6AP表达明显高于空白组和E6AP腺病毒组、E6AP封闭组(P<0.05)；由此表同组E6AP与C/EBPα表达趋势可以看出，E6AP与C/EBPα表达成负性关系，但C/EBPα表达中胺碘酮组与稳心颗粒组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
表1 各组脂肪细胞C/EBPα和E6AP基因mRNA相对表达量比较
3.2 各组前脂肪细胞油红染色结果
图1示，油红染色的是脂肪颗粒，红染越多说明细胞内积累脂肪越多分化越明显。由油红染色结果可知，E6AP封闭组油红染色程度最深，而E6AP过表达组染色最浅，胺碘酮组和稳心颗粒组染色程度相对于空白组有较为明显的减少。
图1 各组前脂肪细胞油红染色结果(放大200倍)
3.3 各组前脂肪细胞C/EBPα、E6AP的蛋白表达结果
表2图2示，E6AP过表达组E6AP表达明显高于空白组和E6AP腺病毒组、E6AP封闭组(P<0.05)，其腺病毒转染有效；稳心颗粒组E6AP蛋白表达明显高于胺碘酮组(P<0.05)，但C/EBPα表达中，胺碘酮组与稳心颗粒组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
注：1：空白组；2：E6AP腺病毒组；3：E6AP封闭组；4：E6AP过表达组5：胺碘酮组；6：稳心颗粒组图2 各组前脂肪细胞C/EBPα、E6AP蛋白Western Blot 结果
4 讨论
急性心肌梗死是一种冠状动脉急性、持续性缺血缺氧引起心肌坏死的临床综合征。Katia Orvin等团队[5]研究7669例AMI患者发现，伴有室性心律失常发生率为3.8%(早期(≤48 h)2.1%，晚期(≥48 h)1.7%)，出现快速室性心律失常患者住院率及1年死亡率显着高于非快速室性心律失常患者。以往研究认为[6-7]，AMI后VT发生主要与梗死心肌纤维化、存活心肌细胞和胶原沉积等瘢痕区域形成了折返性VT底层基质改变心电电传导密切相关,而心肌脂肪化是瘢痕介导VT的底层基质，提示心肌脂肪化在影响AMI后VT发生重要地位。综上所述，预防和降低VT发生在降低AMI死亡风险中具有重大意义。Pooja Pal团队[3]已证实，E6AP能够通过降低C/EBPα的转录能力和心肌脂肪化从而AMI后VT发生，提示上调E6AP抑制C/EBPα转录可能是预防和降低AMI发生VT的重要靶点。
表2 各组脂肪细胞C/EBPα和E6AP蛋白相对表达量比较
心梗后心律失常属于中医学“胸痹”“怔忡”“惊悸”等范畴。结合众多医家对本病的认识，认为本病多为本虚标实，以气血阴阳亏虚为本，瘀血、痰浊、寒凝、气滞等多种因素为标[8]。稳心颗粒以党参为君补中益气; 黄精益气养阴为臣; 三七、琥珀活血化瘀、镇静安神为佐药；甘松理气加强活血为使药，共奏安神定悸、益气养阴、活血祛瘀功效，临床常用于治疗心律失常。研究提示[9-11]，稳心颗粒在治疗心梗后室性心律失常具有良好疗效，得到多名国内着名专家认可并成为共识，可能与稳心颗粒能够改善冠脉供血，改善微循环延缓心室重构和抑制钠通道及L-钙通道，稳定心肌膜电位等机制有关。胺碘酮作为III类广谱抗心律失常药物，能够有效抑制心房及心肌传导纤维的快钠离子内流，降低心肌细胞自律性和传导速度，发挥抗心律失常作用。但胺碘酮具有扩张外周血管降低血压、影响甲状腺功能等副作用，临床应用存在一定缺陷[12]。
本研究结果提示，稳心颗粒组和胺碘酮组都能明显上调前脂肪细胞E6AP表达和抑制C/EBPα表达。结合各组前脂肪细胞油红染色结果可知，E6AP水平上调能够抑制前脂肪细胞分化，这与C/EBPα表达对前脂肪细胞的分化作用相反。由此可推测，胺碘酮和稳心颗粒可能通过上调E6AP水平及负性调节C/EBPα表达抑制心肌细胞脂肪化，但结果显示稳心颗粒E6APmRNA及蛋白表达明显高于胺碘酮组，但在C/EBPα表达中2组无明显差异。考虑本研究所检测基因较单一，其检测基因所涉及上游下游相关因子和相关通路影响尚不明确，其是否存在多通路多蛋白参与E6AP调控尚不得知，且细胞离开复杂的体内内环境调控，研究结果不能完全反映药物在体内的影响，未来仍需进行多通路、多蛋白组学的研究，同时对干预药物最佳浓度及安全性进行探索，进一步实施体内试验进行疗效验证。
