陈晓萍，程 瑛，刘慧馨，沈阿灵,3，褚剑锋,3，谢秋容,3，杨燕燕，彭 军,3△
(1.福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福州 350122；3.福建中医药大学陈可冀学术思想传承工作室，福州 350122；4.福建中医药大学实验动物中心，福州 350122)
高血压是目前最常见的心血管疾病之一，中国高血压调查统计数据显示，我国18岁及以上居民高血压患病率为27.9%，患病人数高达2.45亿，但其知晓率和治疗率仍不足一半，控制率仅为16.8%[1]。据世界卫生组织调查统计显示，高血压导致45%以上的患者死于心脏疾病，可见，在高血压的发展进程中，心脏病是导致患者最终死亡的首要原因之一[2]。因此，防治高血压所致心脏损伤显得尤为重要。
国医大师陈可冀院士在长期的临床实践中，系统总结了高血压的发病规律，形成了中西医结合防治高血压的学术思想，认为高血压早期是其防治的重要突破口，并针对早期高血压以肝阳上亢为主证，伴心火上炎的发病特点，创制了清达颗粒，由天麻(12 g)、钩藤(10 g)、黄芩(6 g)、莲子心(5 g)4味中药组成，具有清肝热、平肝阳、泻心火之效，临床用于治疗早期高血压肝阳上亢、心火上炎证[3]。临床研究证实，清达颗粒显着降低肝火亢盛型1级高血压患者血压[4]。进一步的基础研究证实，清达颗粒能够显着抑制自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)和血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)刺激小鼠血压的持续上升，改善高血压引起的血管重构，并有效抑制心肌肥大、肾脏纤维化、脑组织炎症等靶器官损害[5-10]。然而，其对心脏等靶器官的保护作用和机制仍有待进一步深入。
AngII作为一种重要的心血管活性物质，其异常调控不仅促使高血压的发生与维持，也参与调控心肌能量代谢，导致心脏收缩功能障碍，加剧心室重构的进展[11,12]。课题组前期研究已经证实，清达颗粒能够改善SHR心脏组织内代谢产物的异常调控，减轻心脏炎症，但其对于心肌代谢紊乱的作用机制并不明确[13]。代谢组学通过研究差异表达的内源性代谢产物，观察生物体新陈代谢和内环境稳态中代谢产物的动态变化规律，进一步揭示生物体的生理病理变化，找出与之相关的生物标志物，有助于阐明发病机制及体内能量代谢途径[14]。因此，本研究运用高通量液相色谱-串联质谱技术(Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)进行非靶向代谢研究，分析其调控代谢产物及其通路的潜在机理，以期从代谢调控途径丰富清达颗粒减轻高血压所致心脏损伤的作用机理，为其临床抗高血压应用提供实验依据。本研究已通过福建中医药大学实验动物伦理委员会审查(伦理审查编号2019053)。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级10周龄雄性C57BL/6小鼠15只，体质量(25±2)，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物许可证号SCXK沪2017-0005。福建中医药大学实验动物中心SPF级实验室饲养。
1.2 药物及配制
清达颗粒由天江药业有限公司制备(批号1704306)，根据《药理实验方法学》，按体表面积折算系数换算给药剂量，人与小鼠的折算系数为0.0026，计算出清达颗粒给药剂量为1.145 g/kg/d，给药量为100 μ/只灌胃给药。根据小鼠平均体质量，配制成浓度为286.25 mg/mL的清达颗粒溶液，即称取286.25 mg的清达颗粒粉末置于无菌离心管内，加入1 mL生理盐水充分溶解，每日现配现用。
1.3 主要试剂及仪器
AngII(批号Ab12018)，美国Abcam公司；异氟烷(批号970-00026-00)，深圳市瑞沃德公司；伊红染色液(批号G1100)、苏木素染色液(批号G114)，北京索莱宝公司；植入式胶囊渗透压泵(批号2002D)，美国Alzet公司。
小鼠无创血压测量系统，美国Kent公司；Vevo 2100超高分辨率小动物超声影像系统，加拿大VisualSonics公司；生物组织石蜡包埋机，湖北孝感亚光医用电子技术有限公司；全自动石蜡切片机，德国Leica公司；Illumina Miseq测序仪，美国Illumina公司。
1.4 高血压模型的构建及给药
将C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和清达颗粒组各5只。根据Alzet渗透泵说明书配制AngII溶液，并将其灌注至胶囊泵内，对照组则灌注等体积的生理盐水。随后将装填完成后渗透压泵置于生理盐水中，放在37 ℃恒温箱过夜以平衡。采用异氟烷气体麻醉小鼠，常规消毒后用眼科剪剪开小鼠颈背部，分离表皮及皮下结缔组织植入渗透泵，缝合皮肤切口。模型和清达颗粒组给予AngII埋泵(500 ng/kg/min)，并分别给予生理盐水和清达颗粒溶液(1.145 g/kg/d)灌胃；对照组给予生理盐水埋泵及等体积生理盐水灌胃共2周。
1.5 小鼠无创尾动脉血压检测仪监测血压
采用Kent无创血压仪测量小鼠埋泵14 d后的收缩压、舒张压以及平均动脉压。测量血压前保证环境安静，提前打开加热板使温度处于35 ℃，随后将小鼠装入束缚器中，在距鼠尾根部约1 cm的位置装上闭塞套，然后套入容积压力传感器，在黑暗状态下稳定10 min后开始测量血压。闭塞套和传感器循环充气与放气15次，取其平均值。
1.6 小动物超声检测小鼠心脏功能
采用动物超声仪进行无创的心脏功能测定。前一天行左胸前脱毛后，用2%异氟烷吸入麻醉仰卧位固定于37 ℃恒温加热板上并用1.5%异氟烷维持麻醉，保持心率400-450次/分。在前胸涂抹耦合剂，采用频率为30 MHz的探头取左室长轴切面。用M模式记录心室内径和室壁厚度，并计算出左室射血分数(left ventricle ejection fraction，LVEF)和左室短轴缩短率(left ventricle fractional shortening，LVFS)。
1.7 HE染色观察心脏形态学改变
取小鼠心脏，用4%多聚甲醛中固定24 h后，用石蜡包埋心脏组织，将包埋好的组织用切片机切成4 μm薄片，随后将薄片放至37 ℃水中展片，用载玻片捞起后置于45 ℃恒温箱中烘干。随后进行二甲苯脱蜡处理，苏木素染色，自来水冲洗，碳酸锂饱和水溶液返蓝1 min后进行伊红染色，最后将片吹干，用中性树胶封片，在光学显微镜下观察心脏组织的病理改变情况。
1.8 代谢组学检测
取小鼠心脏组织用液氮碾碎，用含水、甲醇、乙腈和丙酮的提取液(1:3:3:3)提取，将样品在-20 ℃孵育30 min，并在4 ℃离心(14000 rpm，15 min)，除去上清液，放入到新的离心管中进行真空干燥。每个样品的上清液10 mL使用Q Exactive质谱仪分析。质量控制(quanlitycontral，QC)样本从每个萃取后样品中取等量体积混合，14000 rpm离心5 min，将上清液转入新的上样瓶内用于HPLC-MS/MS分析，由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。
1.9 HPLC-MS/MS分析条件
色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 Column (100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱温55 ℃，流速0.35 mL/min。流动相为Buffer A由水、10 mM醋酸铵组成；Buffer B由水、90%乙腈、10 mM醋酸铵组成。按照液相色谱洗脱梯度进行洗脱。质谱条件：正负离子各进行1次扫描，先进行正离子扫描，所有样品结束后再进行负离子扫描，全扫描范围m/z 70-1050。全扫描中选择离子强度TOP10的母离子进行二级质谱鉴定。母离子采用HCD方法进行碎裂，进行二级质谱序列测定，最终生成质谱检测原始文件。
分析条件：将质谱检测得到的原始数据导入用Compound Discover软件进行数据提取处理。处理过程一般包括噪音过滤、保留时间对齐、质谱峰提取、样品间化合物对应、化合物鉴定、Gap的填补、背景值的扣除。其中化合物鉴定利用mzCloud和综合数据库ChemSpider在线搜索完成。采用MetaX软件对数据进行无监督的主成分分析(principal components analysis，PCA)和正交偏最小二乘-判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)，采用OPLS-DA模型第一主成分的变量重要性值投影(variable important in projection，VIP)值筛选差异代谢物，并通过Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)Pathway进行差异代谢物的代谢通路注释和富集分析。
1.10 统计学方法
2 结果
2.1 清达颗粒对高血压模型小鼠血压和体质量的影响
图1A-C示，各组小鼠血压监测结果与对照组比较，模型组小鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，清达颗粒组小鼠的收缩压、舒张压、平均动脉压明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。各组小鼠体质量比较(图1D示)，差异无统计学差意义(P>0.05)。可见，清达颗粒可以抑制Ang II诱导的小鼠血压升高，对小鼠体质量未见明显影响。
注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05
2.2 清达颗粒对高血压模型小鼠心脏功能的影响
图2示，小鼠心脏功能结果，与对照组比较，模型组小鼠的LVEF和LVFS明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，清达颗粒组小鼠的LVEF和LVFS明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。可见，清达颗粒可以改善Ang II诱导的高血压模型小鼠的心脏功能降低。
注：LVEF：左室射血分数；LVFS：左室短轴缩短率。与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05
2.3 清达颗粒对高血压模型小鼠心脏病理形态的影响
图3示，HE染色结果，对照组小鼠心肌细胞排列整齐，横纹结构清晰，细胞质染色均匀，细胞核大小均一。与对照组比较，模型组小鼠心肌细胞排列紊乱无序，横纹结构不清，横截面积明显增大，胞浆染色加深，胞核浓缩深染、部分心肌细胞肿胀变性。与模型组比较，清达颗粒组小鼠心肌组织病理性改变有所改善。可见，清达颗粒可以改善AngII诱导的高血压模型小鼠心脏病理学改变。
2.4 OPLS-DA分析
图4示，在正离子和负离子模式下，QC组样品总离子流色谱(total ionic chromatography，TIC)图重合叠加，表明LC-MS/MS检测系统在整个分析过程中稳定性良好。图5示，监督性OPLS-DA数学建模分析，能有效降低模型复杂性与提升模型分类判别能力，从而直观地观察各组样本间的分类效果和聚集程度。各组间的正、负离子模式下的OPLS-DA得分结果提示，所有样本的代谢成分积分点均处于置信区间内，各组样本点在空间分布上呈左右对称分离趋势，组内聚类程度良好，组间无交叉和重叠，分离趋势明显，分类效果显着，提示组间存在显着的代谢轮廓差异。图6示，置换检验结果提示，OPLS-DA模型无过拟合现象，稳健性良好。可见，模型组与对照组心脏中代谢物存在显着差异，清达颗粒给药后小鼠的代谢亦发生显着变化。
图3 各组小鼠心脏病理形态的比较(×400)
A.负离子模式TIC图；B.正离子模式TIC图。
A.模型组与对照组的负离子OPLS-DA得分图；B.模型组与对照组的正离子OPLS-DA得分图；C.清达颗粒组与模型组的负离子OPLS-DA得分图；D.清达颗粒组与模型组的正离子OPLS-DA得分图
A.模型组与对照组的负离子置换检验结果图；B.模型组与对照组的正离子置换检验结果图；C.清达颗粒组与模型组的负离子置换检验结果图；D.清达颗粒组与模型组的正离子置换检验结果图
2.5 差异代谢物筛选
以VIP>1、差异倍数(fold change，FC)>2.0或FC<0.5且P<0.05为筛选条件获得各组差异代谢物(differential expressed metabolomic，DEM)，模型组与对照组间差异代谢产物共25个，其中正离子模式下15个，负离子模式下10个，清达颗粒组与模型组间差异代谢物共112个，其中正离子模式下72个，负离子模式下40个。通过差异代谢物火山图可以看出，距离中心越远的点越有可能成为潜在的生物学靶点。将模型组与对照组间的差异代谢产物，与清达颗粒组和模型组间的差异代谢产物进行比较，分析差异代谢产物以观察清达颗粒治疗后的变化趋势。图7表示，结果提示清达颗粒干预能够显着缓解AngII刺激后组氨酸、腺嘌呤、油酸、亚油酸、惊厥毒素、棕榈酰鞘磷脂、戊烯酸的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。
注：圆圈大小代表变量重要性值投影(variable important in projection，VIP)值
表1 差异代谢产物信息比较
2.6 代谢通路富集分析
图8示，将筛选出的各组差异代谢物导入KEGG数据库进行代谢通路富集分析，结果显示模型组与对照组间的差异代谢产物共富集23条代谢相关通路，清达颗粒组与模型组间的差异代谢产物共富集16条代谢相关通路。将差异代谢通路进行交集分析，共涉及9条代谢路径：亚油酸代谢(linoleic acid metabolism)、嘌呤代谢(purine metabolism)、苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)、泛酸和辅酶A生物合成(pantothenate and CoA biosynthesis)、不饱和脂肪酸的生物合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids)、脂肪酸生物合成(fatty acid biosynthesis)、次生代谢产物生物合成(biosynthesis of plant secondary metabolites)、角质、软木质和蜡质生物合成(cutin, suberine and wax biosynthesis)、玉米素生物合成(zeatin biosynthesis)。
注：A.模型组与对照组KEGG通路富集柱状图；B.清达颗粒组与模型组KEGG通路富集柱状图；C.模型组与对照组与清达颗粒组与模型组通路交集
3 讨论
高血压是全球心血管疾病的死亡首因，研究报道每年超过940万人死于高血压[1]。截至2016年底，我国高血压患者已达2.45亿，患病率为27.90%且呈逐年上升趋势，而目前我国高血压患者的控制率仅有16.8%，即使血压控制良好的患者，仍存在心、脑、肾等靶器官损害，并最终死于这些靶器官损害，严重威胁人类的生命和健康，造成了严重社会负担和经济负担[15]。因此，防治高血压所致心脑肾等靶器官损害是防治高血压的重要环节。清达颗粒是在陈可冀院士治疗早期高血压的临床经验方，天麻平肝抑阳、息风止痉为君，钩藤清热平肝、息风定惊为臣，黄芩清热泻火为佐，莲子心清心除烦安神为使，共同发挥出清肝热、平肝阳、泻心火的作用[3]。临床与基础研究证实，清达颗粒降压效果显着，且具有心、脑、肾靶器官保护作用，但其调控作用和机制仍有待进一步深入。
在高血压发生发展的进程中，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)的激活是其最关键的使动因素，该系统中最重要的效应物质为Ang II，AngⅡ与其受体相结合引起相应的生理效应，醛固酮分泌增加，水钠潴留进而导致高血压的发生与维持[16]。前期研究证实，清达颗粒能够缓解自发性高血压大鼠和AngII刺激模型小鼠血压升高[5-10]。本研究同样通过AngII诱导的高血压模型小鼠，且进一步验证了清达颗粒良好的降压效应。慢性升高的动脉血压会增加靶器官的压力负荷，血管重塑和内皮功能异常，可直接影响心、脑、肾等器官的灌注；血压升高还可以引起交感神经和RASS系统过度激活、代谢异常及炎症反应，这些非血流动力学改变也将进一步加重、加速靶器官损害[17]。因此，在高血压的防治过程中，控制血压的持续上升，并保护心、脑、肾等靶器官损害尤为重要[18]。在心脏保护方面，前期研究发现清达颗粒具有减轻心脏炎症和纤维化的作用。本研究通过心脏超声和HE染色结果验证了清达颗粒改善AngII诱导的高血压模型小鼠的心脏功能降低和病理形态改变，但其深入的调控机制仍有待进一步深入。
心脏能量代谢是心肌肥大、心力衰竭等心血管疾病的研究热点，纠正心肌能量代谢重构有望成为开辟心脏相关疾病治疗的新向导[19]。本研究通过代谢组学方法筛选出差异代谢物和代谢通路。通过多元统计分析，共筛选出AngII刺激可导致心脏损伤的相关差异代谢产物25个，清达颗粒干预可显着改变其中8个代谢物，分别为组氨酸、腺嘌呤、油酸、亚油酸、惊厥毒素、棕榈酰鞘磷脂、戊烯酸。对差异代谢产物进行KEGG通路富集分析，提示清达颗粒对高血压心脏损伤与苯丙氨酸代谢、嘌呤代谢、泛酸和辅酶A生物合成，不饱和脂肪酸的生物合成，亚油酸代谢通路等多条代谢通路的调控相关。以往研究发现，高血压及其所致心肌肥厚与苯丙氨酸代谢紊乱密切相关[20,21]。此外，嘌呤代谢异常将导致其终产物尿酸分泌失衡，与高血压的进展具有协同效应[22,23]。本次研究结果表明，清达颗粒可以显着改善高血压心脏受损过程中的氨基酸、嘌呤以及多种其衍生产物的改变，调节多条代谢通路，从而促使心脏代谢趋于正常化。这也可能是清达颗粒发挥心脏保护作用的重要机制和途径之一。然而相关代谢产物对心脏功能、病理的影响及清达颗粒的干预作用仍有待进一步深入探讨。本次研究在前期基础上进一步从代谢层面丰富清达颗粒治疗高血压心脏损伤的作用机制，有助于为其临床抗高血压应用提供更多实验依据。
