徐小珊,熊罗节,马 伟,翟春涛,李 玮,田岳凤△

(1.湖南中医药大学针灸推拿与康复学院,长沙 410208;2.山西中医药大学第二临床学院,山西晋中 030619)

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome,CFS)是属于亚健康状态的一种特殊表现,又称第三状态,也称病前状态、灰色状态、潜病期、亚临床期、临床前期等,可见无明显诱因且休息后无法缓解的疲劳。患者尚无临床症状或症状感觉轻微,但已出现潜在病理信息,常伴免疫力低下。团队前期研究表明隔药饼灸对机体免疫功能有显着调节作用[1],但具体机制尚不明确,本次实验采用力竭游泳与慢性束缚交替的方法复制CFS大鼠模型,观察隔药饼灸“神阙”“关元”“足三里”“期门”对CFS大鼠血清中免疫球蛋白(Ig)A、IgG、补体C3以及肌肉组织中T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein, Tim)-3、淋巴细胞活化基因(lymphocyte-activation gene,LAG)-3的影响,从而探讨隔药饼灸的免疫干预效应。本研究通过山西中医药大学实验动物医学伦理委员会批准,编号:2020DW009。

1 材料

1.1 动物

SPF级SD大鼠50只,雌雄各半,体质量(200±20)g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2019-0010。大鼠饲养于山西中医药大学动物房,环境温度20～25 ℃,湿度30%～50%,鼠笼与水壶定时清洗并消毒,垫料及时更换,保证环境清洁与空气流通。整个实验过程中对动物的各项处理均严格遵守2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》[2]。

1.2 主要仪器与试剂

苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色液(货号BA4025),珠海贝索BASO公司;封片剂(货号10004160),上海国药厂;酶联免疫IgA(货号MM-0062R1)、IgG(货号MM-0064R1)、补体C3(货号MM-0353R1)试剂盒,上海酶联生物科技有限公司;Trizol试剂盒(货号B511321),上海生工生物工程股份有限公司;琼脂糖B(货号A600014)、核酸染色剂(货号A606695),香港(中国)BBI生命科学公司;逆转录试剂盒(货号EP0743)、荧光定量PCR试剂盒(货号B300721),美国赛默飞世尔科技公司。

ZH-YLS-181型悬尾测定仪,安徽正华生物仪器设备有限公司;OFT-100型旷场实验箱,成都泰盟软件有限公司;SM600型酶标仪,上海永创医疗器械有限公司;CX41型生物显微镜,中国奥林巴斯有限公司;DYY-6C型电泳仪,北京六一生物科技有限公司;FR980型凝胶成像系统,上海复日科技有限公司;SMA4000型微量分光光度计,北京美林恒通科技有限公司;LightCycler480 Ⅱ型荧光定量PCR仪,瑞士Rotkreuz公司。

1.3 艾灸与药饼材料制备

艾绒(国药准字Z32020253),江苏康美制药有限公司;艾炷:用模具制成底径约0.5 cm、高0.7 cm,质量约(0.052±0.015)g的圆锥形艾炷,备用。

逍遥散组方:柴胡、白芍、当归、茯苓、白术各30 g,炙甘草15 g,薄荷10 g,烧生姜10 g,中药饮片购自山西中医药大学附属医院。按组方剂量打碎成粉末,过90目筛,将药粉与赋型剂按1:1比例调匀成泥状,用模具制备为底径0.8 cm,高0.2 cm,质量(0.12±0.03)g的药饼,牙签刺5个小孔,备用。假药饼只用赋型剂制备,方法同隔药饼。

1.4 中药悬浊液制备

按70 kg成人每日临床用量9 g为标准,大鼠的等效剂量相当于人的6.3倍,可得逍遥散悬浊液的浓度约为60 mg/kg。将逍遥散组方药粉按比例配制成悬浊液,备用。

2 方法

2.1 造模方法

根据随机数字表法将大鼠分为空白组、模型组、隔药饼灸组、假药饼灸组、中药灌胃组,共5组,每组10只。适应性喂养7 d后,对除空白组外其余4组大鼠进行CFS造模,依据文献选择复合造模方法,21 d内施加力竭游泳(身体疲劳)与慢性束缚(心理疲劳)2种造模因素[3-5]。造模后行为学检测(旷场实验与悬尾实验)结果显示模型组大鼠各项指标均发生显着变化,提示造模成功。

力竭游泳模型制备方法:每日上午9:00,大鼠在自制游泳箱中自由游泳,游泳时水深约30 cm,水温(22±3)℃,以大鼠游泳动作明显失调或头部沉入水中10 s不能浮出水面为力竭标准。

慢性束缚模型制备方法:将大鼠放入自制束缚筒内,关闭闸门并收紧瓶身,限制活动。每日下午1:00开始,每次束缚3 h。束缚期间注意观察大鼠状态,避免其因情绪过度紧张或呼吸不畅死亡。

2.2 干预方法

造模结束后第2天开始干预治疗,空白组和模型组大鼠不做任何干预。

隔药饼灸组:使用之前制备好的药饼与艾炷,选取大鼠“神阙”“关元”“足三里(双)”“期门(双)”共6个穴位,治疗前将各穴位处毛剪去,放置药饼与艾炷,点燃艾炷、燃尽更换,每穴灸5壮,每日灸,连灸10 d。穴位定位参照《实验针灸学》常用动物穴位定位法以及拟人比照法[6-7],“神阙”位于大鼠脐正中央;“关元”位于脐下约25 mm处,大鼠第3、第4对乳头连线中点水平与腹白线相交处;“足三里”位于膝关节后外侧,腓骨小头下约5 mm处,左右各一穴;“期门”位于胸侧部第6肋间,肋骨与肋软骨交界处,左右各一穴。

假药饼灸组:与隔药饼灸组干预方法相同,穴位处放置赋形剂制备的假药饼,每穴灸5壮,每日灸,连续10 d。

中药灌胃组:使用制备好的逍遥散悬浊液,在艾灸治疗基础上每日按大鼠体质量进行灌胃给药,连续10 d。

2.3 样品采集及处理

干预治疗结束后次日,将大鼠麻醉后迅速腹主动脉取血,取上清液于-20 ℃保存待测。同时取大鼠肝脏、脾脏及双侧股四头肌组织,置于0.9%氯化钠溶液中清洗至表面无血迹,并用滤纸吸干。肝脏、脾脏组织置于4%多聚甲醛溶液中固定,用于常规HE染色。股四头肌组织置于液氮中冻存,用于荧光定量PCR检测。

2.4 指标检测

2.4.1 血清中IgA、IgG及补体C3的含量 采用ELISA法测定各组大鼠血清中IgA、IgG及补体C3的含量,具体步骤参照试剂盒说明书。

2.4.2 大鼠肝脏、脾脏组织病理学变化 从4%多聚甲醛溶液中取出各组大鼠肝脏、脾脏组织,梯度脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片(3～5 μm),常规HE染色,显微镜下观察病理学变化。

2.4.3 肌肉组织Tim-3、LAG-3 mRNA水平 采用实时荧光定量PCR方法,将各组大鼠冰冻的股四头肌组织用Trizol法进行总RNA提取,反转录为互补的cDNA并设定反应条件后扩增。以β-actin为内参,所得数据用2-△△Ct法进行mRNA相对定量分析。引物序列见表1。

表1 引物序列表

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 行为学实验结果

3.1.1 旷场实验结果 与空白组比较,模型组大鼠旷场实验水平跨格数与站立次数显着降低(P<0.05);与模型组比较,隔药饼灸组与中药灌胃组大鼠水平跨格数与站立次数均显着升高(P<0.05),且2组间比较差异无统计学意义(P>0.05);假药饼灸组与模型组比较差异均无统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠旷场实验结果

3.1.2 悬尾实验结果 与空白组比较,模型组大鼠悬尾实验挣扎次数显着减少,不动时间明显增加(P<0.05);与模型组比较,隔药饼灸组、假药饼灸组与中药灌胃组大鼠挣扎次数明显上升,不动时间显着下降(P<0.05);隔药饼灸组与中药灌胃组比较,大鼠挣扎次数与不动时间差异均无统计学意义(P>0.05);与假药饼灸组比较,隔药饼灸组与中药灌胃组大鼠挣扎次数上升(P<0.05),但不动时间差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 各组大鼠悬尾实验结果

3.2 ELISA实验结果

与空白组比较,模型组大鼠血清IgA、IgG与补体C3含量明显降低(P<0.05);与模型组比较,隔药饼灸组与中药灌胃组大鼠血清IgA、IgG与补体C3含量均明显升高(P<0.05);与中药灌胃组比较,隔药饼灸组大鼠血清IgA、IgG含量升高(P<0.05),补体C3含量差异无统计学意义(P>0.05);假药饼灸组与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表4。

表4 各组大鼠血清IgA、IgG、补体C3含量比较

3.3 HE染色实验结果

3.3.1 肝脏组织病理结果 空白组大鼠肝小叶结构完整且清晰,以中央静脉为中心向四周放射状排列,同时肝细胞结构完整,肝窦正常,胞核结构清晰,核大,呈圆形;模型组大鼠肝小叶结构较完整,肝细胞索结构模糊,肝细胞排列基本整齐,可见散在细胞体积缩小,胞质密度增加,核质浓缩,核膜核仁破碎,偶尔可见凋亡小体;隔药饼灸组与中药灌胃组大鼠肝小叶结构与空白组相近,肝细胞索结构基本整齐,偶见细胞体积缩小,核质浓缩;假药饼灸组大鼠肝细胞索排列不清,可见部分肝细胞体积增大,出现水肿,见图1。

图1 各组大鼠肝脏组织HE染色结果比较(×200)

3.3.2 脾脏组织病理结果 空白组大鼠脾脏组织白髓结构完整,数量多且形态较规则,红白髓分界较清楚,脾小节较大,淋巴细胞密集。模型组大鼠白髓数量明显减少且结构不规则,淋巴细胞数量明显减少,脾小节明显缩小,红白髓移行区消失,红白髓交织在一起,白髓数量减少,部分被红髓替代。隔药饼灸组与中药灌胃组大鼠白髓结构较完整,红髓数量有所上升,形态较规则,呈现过渡阶段,脾小节较空白组有轻微变小,淋巴细胞密度较大,总体具有明显的红白髓移行区,但部分红白髓分界不明。假药饼灸组大鼠淋巴细胞数量较模型组增加不明显,脾小节变小,红白髓交织且白髓结构不规则,见图2。

图2 各组大鼠脾脏组织HE染色结果比较(×200)

3.4 荧光定量PCR结果

与空白组比较,模型组大鼠股四头肌Tim-3、LAG-3 mRNA水平显着升高(P<0.05);与模型组比较,隔药饼灸组与中药灌胃组大鼠股四头肌Tim-3、LAG-3 mRNA水平显着降低(P<0.05),假药饼灸组Tim-3 mRNA水平降低(P<0.05);隔药饼灸组与中药灌胃组组间比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表5。

表5 各组大鼠股四头肌Tim-3、LAG-3 mRNA水平比较

4 讨论

CFS患者常出现无明显原因的持续或间断性发作疲劳(>6个月),且常伴低热、肌肉酸痛、睡眠质量下降等症状[8]。目前对于CFS发病机制的研究结果尚不明确,研究者认为与多系统失调相关,可能为免疫系统紊乱、神经内分泌系统失调、能量代谢异常、心血管系统异常等复合作用导致[9]。免疫系统和全身能量代谢处于低水平状态时,患者往往易产生疲劳症状,进而影响其神经与心血管功能,导致认知功能出现障碍,影响患者日常工作与生活[10-11]。现代医学对CFS尚无针对性强的治疗手段,多采用补充维生素等营养疗法、抗抑郁药物以及多种非药物疗法,但疗效仍存在一定局限性[12]。而中医治疗CFS效果较好,使用中药或针灸治疗能调节细胞免疫,提高机体免疫力,减轻神疲乏力、抑郁易怒等症状,恢复机体活力[13-14]。

中医学认为,CFS根据其主要临床表现,被称为“郁证”“虚劳”,其病机多为本虚标实,主要与肝、脾密切相关,临床最常见的证型则为肝郁脾虚。《素问·五藏生成论篇》曰“肝受血而能视”,体现了肝藏血主疏泄功能保障人体正常的生命活动,肝气不舒则情志不调,容易出现焦虑抑郁的状态。脾主四肢肌肉,“脾气虚则四肢不用”,脾虚则筋脉失养、气血生化乏源,而见神疲乏力、不欲动。因此在临床应对症治疗,疏肝气以调畅情志,补脾气以充气血,可以采用疏肝解郁、补气和血的逍遥散组方。逍遥散作为经方,由甘草、茯苓、当归、白芍、白术、柴胡组成,善治肝郁脾虚证,对肝气郁结所致的咽干口燥、两胁作痛与脾虚所致的疲劳难愈、气血亏虚都有较好的改善效果[15-16]。另一方面,实验选取“神阙”“关元” “足三里”“期门”穴共同配合来干预CFS。“神阙” “关元”均为任脉之所属,神阙穴与任、督、冲脉等相关进而统属全身经络,为人体生命之门,有调气补脾、强壮保健之效,关元穴为足三阴经交会之处,《医经理解》认为关元穴为“男子藏精,女子蓄血之处。是人生之关要,真元之所存也”,可培本固元、补益元气。足三里为足阳明胃经之合穴,善补益脾气、调理脾胃,可以有效增强人体免疫力,抵抗疲劳[17-18]。另期门穴为肝经之募穴,有健脾疏肝、理气活血的作用,针刺期门可以有效缓解CFS患者抑郁焦虑的精神状态[19]。

本实验采用隔药饼灸的方法,将逍遥散组方药按标准制成药饼,并将其置于大鼠“神阙” “关元” “足三里” “期门”等穴位上。研究结果显示:隔药饼灸相较于单纯艾灸疗效更佳,除艾灸的热效应外,逍遥散组方药物透皮吸收后能够更好地发挥疗效,针对性改善CFS肝郁脾虚证。同时隔药饼灸相较于单纯口服中药,加入了艾灸带来的温热刺激效应,艾灸本就具有温通经脉、调和气血作用,热力熏蒸能促进机体透过皮肤对药物进行吸收,还能使药效经穴位、经络传输,刺激人体产生应激反应,有效抵御病邪,增强抵抗力。正如《灵枢·官能》所云“针所不为,灸之所宜”,隔药饼灸疗法集药物、穴位、艾灸三者作用于一体,药效进一步深入人体各脏腑,能够调节免疫球蛋白浓度从而提高免疫力,增强免疫功能[20-21]。

根据CFS的发病机制假说,本次实验主要研究隔药饼灸能否通过干预免疫系统中紊乱的免疫球蛋白与T细胞调节因子,进而影响CFS发展进程。IgA、IgG是体液免疫的重要防线,与相应抗原结合后可以激活补体,IgA为黏膜防御系统的重要成分,IgG的主要功能为抗感染[22]。而补体C3作为血清中含量最高的补体成分,是补体激活途径中最重要的环节,参与机体的特异性免疫[23]。它们的含量与机体免疫水平存在一定因果关系,也是实验中常用的免疫学指标。

有实验研究发现艾灸“关元”穴能有效升高CFS模型大鼠血清中的IgA、IgG与补体C3水平,提示艾灸可以提高CFS大鼠的免疫功能,且与穴位配伍能使疗效更优[24]。另有研究观察在CFS疾病发展过程中,IgA、IgG、IgM的含量可以作为突出指标,来观测针灸对疾病的治疗效果[25]。本实验结果显示,与单纯中药灌胃和假药饼灸相比,隔药饼灸更能有效恢复CFS大鼠免疫球蛋白IgA、IgG、补体C3的含量,提示隔药饼灸干预手段可能通过调节体液免疫、增强免疫功能来达到治疗CFS的目的。

Tim-3基因是癌症研究常观察的靶点之一,在多种T细胞上均可存在,被认为可以提高癌症免疫治疗的疗效,并被探讨是否可以作为治疗癌症的新方法[26-27]。Tim-3存在于巨噬细胞、树突状细胞、CD4+T、CD8+T上,影响细胞凋亡与吞噬[28],同时它作为免疫负调节因子,能有效调控T细胞的增殖与分化,抑制T细胞的免疫应答,诱导免疫耐受,与多种自身免疫性疾病、免疫衰竭疾病相关[29]。本次实验检测Tim-3基因表达后发现,这种T细胞表面抑制性分子在CFS模型大鼠肌肉组织中出现表达上调现象,经隔药饼灸治疗后下降,说明隔药饼灸可能阻断Tim-3基因表达,调节细胞免疫进而抑制疾病的发生发展,有助于CFS疾病免疫耐受的恢复,为后续实验与临床研究提供了新的思路。

LAG-3作为重要的免疫调控分子,主要表达于自然杀伤细胞、树突状细胞,以及活化的T细胞上,是单链跨膜蛋白,与主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(major histocompatibility complex,MHC-Ⅱ)结合共同抑制T细胞活化[30]。LAG-3作为新兴的免疫检查点,与特异性T细胞的免疫调节相关,属于免疫负调节因子[31]。本次研究发现隔药饼灸能下调CFS模型大鼠LAG-3 mRNA表达,再次证明隔药饼灸增强机体免疫功能的效果显着。

综上所述,本研究结果提示隔药饼灸可以明显缓解CFS大鼠疲劳状态,且对免疫系统具有正向刺激作用,能够提升IgA、IgG、补体C3的含量,下调Tim-3、LAG-3 mRNA的表达水平,同时改善肝脾组织病理形态,这可能是隔药饼灸改善CFS的作用机制之一。