李大吉
（白城师范学院生命科学学院 吉林 白城 137000）
冷冻精液在目前的畜牧生产中，起着至关重要的作用。这项技术不但可以使企业节约成本，还将畜禽良种选育工作得到进一步执行。但由于猪精子对低温非常敏感，冷冻过程有可能严重损害精子顶体膜[1]，从而使精液的受精能力低下，对猪冻精产业受到了极大的阻碍。因此，本研究的目的是通过对冷冻与解冻处理过程中，猪精子质量及顶体完整性的数据分析，进一步优化猪精液冻融程序。为日后研究如何更优良的保护冻融精子提供理论依据。
1 实验内容
1.1 精液的预处理
采集精液之后，镜检活率大于90%，才能用于实验。精液在室温静止半个小时后，弃上清，静置待用。
1.2 精液的冷冻-解冻
冷冻过程：将托架放到液氮面上，盖上容器平衡10min。然后将细管水平摆好放在托架上，使其在液氮面上熏蒸10min，之后迅速浸入液氮内保存。
解冻过程：将细管从液氮中取出，迅速投入37℃的水浴中，解冻60s，待其解冻后，擦干细管上的水珠，测精液的质量。
1.3 精液的品质检查
1.3.1 精子活率的测定
37℃，45s水浴解冻，然后用等温的解冻液稀释后，取10μl精液于载玻片上，在显微镜下评定精子活率。
1.3.2 精子顶体完整率的测定
将待测精子进行姬姆萨染色法染色。制作后用400倍镜下检查5个不同视野，计数200个精子。
1.3.3 精子质膜完整性的低渗膨胀测定
待测精液用精子低渗液稀释调整密度，取10μl精子悬浮滴于血细胞计数板上，在显微镜下观察，计算弯尾精子百分率。
2 结果与分析
不同甘油浓度对精子质量的影响：
从表1中可以看出，以2%和4%甘油浓度对精子预处理组，冻融后猪精子的质量明显高于对照组和其它浓度组（P＜0.05），其活率分别为36.2%和35.5%；顶体完整率分别为35.4%和35.2%；低渗膨胀率分别为33.8%和34.2%。可见浓度为2%和4%的甘油在冻融过程中可以更有效地保护精子，使精子质量更高，从而提高冻融精子的实际利用价值。
3 讨论
冻融过程中不同处理对猪精子质量的影响：
表1 不同甘油浓度对精子质量的影响（n=12）
每种细胞都有它理想的冷冻与解冻速率，Mazur等（1972）给出两条理论原则：（1）冷冻速率太慢时，与冷冻保护剂接触时间过长，精子容易受冷冻保护剂的毒害作用而死亡或遭受破坏；（2）冷冻速率过快时，细胞内液体易导致结冰现象，对细胞造成物理或化学损伤。解冻时的原理恰好相反。在猪精液冷冻过程中，为了保持精子活力和顶体的完整率，理想的冷冻速率推荐为：0.5mL细管采用30℃/min、3%甘油浓度[2]，或者0.25mL细管采用50℃/min、1.5%甘油浓度[3]。当5mL大型细管在3.3%甘油浓度下冷冻时，为达到最佳的解冻效果，冷冻速率应较慢，为 16℃/min[4]。
4 结论
本试验是将猪精液进行冷冻和解冻处理，并对处理后的猪精子质量进行检测，然后与新鲜精子蛋白进行对比。通过本试验的完成得出以下结论：冷冻过程中，添加2%或4%浓度的甘油，可有效提高冻融精子的质量。
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［4］Woelders H,Den Besten.Cryopreservation of boar semen with small betweenboar variation of post-thaw sperm survival[J].Cryobiology,1993,30:645.
