苏美燕
(莱阳慧农养殖服务有限公司 山东 莱阳 265200)
0 引言
仿刺参（Apostichopus japonicus）又称灰刺参、刺参，是海参中质量最好的一种，被誉为“参中之冠”，主要分布于我国的辽宁、山东和河北沿海，主产于烟台、威海、长山岛、大连等地。自20 世纪50 年代以来国内逐渐开展了刺参人工育苗及增养殖技术研究工作，相继开展了刺参人工育苗生产，生产规模不断扩大，现在每年生产的刺参商品苗已突破亿枚，甚至高达数十亿枚，居世界首位。
同时，刺参养殖业的迅猛发展和不规范运作也造成了病害问题日趋突出，出现了多种明显病症和大规模死亡现象，部分养殖区相继发生了很多疾病。 苗种培育的成败是决定仿刺参养殖产量的重要因素。有关海参疾病的研究,国内外报道多属疾病的调查范畴。 本文对刺参育苗期烂边病及其致病源进行分析，以期为刺参病害防治提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材
患病耳状幼体取自山东蓬莱某发病仿刺参育苗池，经镜检有明显的烂边症状，体长650－700μm。 以虹吸法抽取适量发病育苗池池水至消毒塑料瓶，水中含患病幼体约1 万只，充气，人工感染用健康幼体采自山东蓬莱一仿刺参育苗场，体长650μm－700μm。
1.1.2 培养基及试剂
细菌分离用培养基TSA 和TCBS 均购自北京陆桥技术有限责任公司；ID32E 细菌鉴定系统试验条购自生物梅里埃中国有限公司；抗菌药物药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。
1.2 病参的显微镜检
以无菌烧杯取发病池水，静置5min，吸取烧杯底部池水置显微镜下观察，选取其中典型的烂边耳状幼体，制作水浸片逐一镜检，初步观察记录幼体病变情况。
1.3 病原的分离纯化
以300 目无菌筛绢过滤池水得到患病幼体， 用无菌海水充分洗涤，并收集于Eppendorf 管，将患病幼体离心(2800×g，5min)富集后，以无菌研钵充分研磨。在无菌条件下，用接种环挑取研磨后得到的样品，在TSA 和TCBS 固体培养基上划线分离；将平板置于28℃恒温生化培养箱培养，38h 后挑取优势菌落，连续进行4 次纯化培养得到优势菌。
1.4 菌种鉴定
1.4.1 形态观察纯培养的细菌于28℃培养24h 后，进行革兰氏染色和光镜观察。
1.5 人工回接感染
1.5.1 菌悬液的制备
用接种环将分离所得优势菌接种于液体培养基中放在培养箱（28℃160-180r/min）中振荡培养24h，取出离心(4000×g，5min)得到菌泥，用1.5%的灭菌生理盐水将所得优势菌制成悬液，并用麦式比浊法确定浓度。
1.5.2 浸浴法人工回接感染
将12 个2L 的烧杯置于盛有20L 自来水的塑料水箱（底部设置加热棒）内，烧杯内底部放置一块圆形波纹板(面积同烧杯的底面，紧贴烧杯内壁)，注入无菌海水1L，调节整个系统温度于19－22℃。 在各烧杯内投放健康耳状幼体，使其终密度为1.1cells/mL。 各感染组烧杯中加入菌悬液， 使细菌终浓度分别为1.0×104cells/mL、1.0×105cells/mL、1.0×106cells/mL、1.0×107cells/mL 和1.0×108cells/mL，空白对照组不加细菌。 各感染组和对照组均设2 个平行。 实验期间投喂新月菱形藻和红酵母，投喂量为2.5×104cells/mL;每天换水1 次，换水量为1/2(感染组需补充细菌，维持感染浓度);整个实验光强控制在1300lx 左右。 每隔5h镜检幼体情况， 并从感染后出现症状的幼体中再次分离优势细菌，进行形态及生理生化指标分析（方法同前）。
1.6 药敏试验
选用生产中常用药物，采用纸片法进行药敏测试；用麦式比浊法配制浓度大于1×109cells/mL 的菌悬液约1mL， 吸取100μL 均匀涂布于TSB 培养基上，贴上药敏试纸，于28℃培养箱恒温培养24h，观察有无抑菌圈产生，判断药物敏感性。
2 结果与分析
2.1 患病幼体症状观察、病原初检和优势菌分离
经镜检发现：患“烂边症”的耳状幼体失去浮游能力、活力下降，体表边缘发黑、粗糙并出现不同程度的溃烂，严重者发生解体、自溶。 在患病个体溃烂组织处均发现大量活跃的细菌，未发现寄生虫、霉菌等其它病原，由此可初步确定细菌是主要病原。 分离得到1 种优势菌株记为RES-1。 RES-1 在TSA 培养基上的菌落为圆形,边缘光滑,湿润不透明,呈微黄。 并在TCBS 培养基上生长良好且使培养基变成黄色。
2.2 细菌学鉴定结果
细菌RES-1(从病参分离)、RES-2(从人工感染病参分离)均呈革兰氏阴性，短杆状略有弯曲。
2.3 人工回接感染结果
优势菌RES-1 对健康仿刺参幼体的浸浴感染实验结果见表1。 5个感染组均出现“烂边”症状，出现时间分别为实验开始后的第30、25、20、10 和5h。观察比较25h 和50h 内刺参状况发现：随着感染时间的延长，各感染组烧杯水层中健康幼体逐渐减少并开始下沉，而烧杯底部幼体检出数逐渐增多(除了1.0×108和1.0×107感染组因细菌剂量高幼体已发生解体、 自溶， 故50h 时烧杯底部上的幼体检出数少于25h 时)。 通过镜检发现各感染组幼体均出现规律性的病变:感染初期幼体活力下降，浮游能力降低，继而体表外周明显加厚、颜色发黑;有的幼体胃部发黑萎缩，停止摄食，体壁肿大并崩解;随着感染时间的推移，幼体发生溶解并最终解体、死亡；而对照组幼体未发生烂边症状。从出现“烂边”症状的幼体中再次分离病原，得到优势菌RES-2，对其进行形态学及生理生化分析，结果与RES-1 完全一致，结果符合科赫法则。
2.4 药敏实验结果
菌株RES-1 对生产中常用的抗菌药物的敏感性检测见表2。 菌RES-1 对少数抗生素，包括链霉素、四环素、利福平、青霉素G、强力霉素不敏感，对其它受试抗菌药物较敏感。
3 讨论
目前，中国仿刺参养殖技术从人工育苗到成参的养殖和人工增殖均处于世界领先水平，仿刺参养殖经济效益高，市场发展空间巨大，已成为我国北方海水养殖的支柱产业。 随着海参业的迅猛发展，出现了技术落后和病害等一系列问题，长期以来有关仿刺参的研究主要集中在繁殖生物学、育苗技术、养殖生态以及药用活性物质等，对近几年来养殖及育苗中出现的各种病害只有简单外在的描述，并未进行较深入系统的研究。 中国仿刺参养殖主要集中在山东和辽宁沿海地区，也是海参各种疾病流行较广泛的地区，包括腐皮综合征、烂边症、烂胃病、化板症、细菌性溃烂病、盾纤毛虫病、霉菌病、扁形动物病和后口虫病等，严重制约着水产养殖业的发展。而近几年在辽宁、山东等地仿刺参浮游期幼体时期较广泛流行的疾病是“烂边症”。 该病具有流行性广、死亡率高等特性。王印庚等首先对浮游期幼体的“烂边症”进行了病原学研究。 发现该病是有弧菌属细菌引起，该菌是危害水产养殖动物的重要病原之一，也是引发海参疾病的主要病原。山东长岛、胶南等地育苗场均有该病发生，死亡率达70%以上，可见其危害相当严重，鉴于此本文对该烂边症的病原及其致病来源作了再次的分析。通过培养基培养分离出优势菌株，将分离的优势菌株进行人工回接感染，结果符合科赫法则，因此最终确定了“烂边症”的病原。进一步从形态学、生理生化方面对病原进行分析，将其鉴定为弧菌属灿烂弧菌。在本研究中，对水产生产中常用的抗生素进行了敏感性检测，结果发现病原菌对一些抗生素具有抗药性，而对大多数受试药物敏感，这些药物均可考虑在生产中用于该病的防治。因此，在本研究的基础上，我们建议在养殖生产中，为了避免烂边症的发生，一方面，应杜绝病原菌进入养殖系统，进一步严格进行饵料质量检测和净化育苗水体，包括水源水、亲参育苗系统等;另一方面，在进行药物防治时，药物选择必须对病原有针对性，切忌滥用抗生素。
表2 菌株RES-1 的药敏实验结果
