张彩乔 耿风廷

（华北制药金坦生物技术股份有限公司，河北 石家庄 050000）

0 概述

蛋白质的分离纯化在现代医学、药学、生物化学等方面使用广泛，是一项关键核心技术。尤其是随着生物制药的迅猛发展，蛋白质作为药品中的一部分应用越来越广泛，而作为药品，如何将目的蛋白进行分离提纯就显得尤为重要。

每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异。蛋白质分离提纯就是利用不同蛋白间内在的相似性与差异，将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。现在生物制药研究中，尤其是大规模生物制药生产上，蛋白质分离纯化技术主要应用各项层析技术，其中包括亲和层析、离子交换层析、反相层析、疏水层析、分子筛层析等等。

1 亲和层析

在生物分子中有些分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合，如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。生物分子间的这种结合能力称为亲和力。亲和层析就是根据这样的原理设计的蛋白质分离纯化方法。

将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。

2 离子交换层析

离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阳离子交换树脂；而带有负电荷的称之阴离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH 条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH 值洗脱下来。

3 反相层析

在吸附层析中，高极性物质在层析柱上吸附较牢，洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题。如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相层析。

4 疏水层析

疏水层析和反相层析（reversed phase chromatography）分离蛋白质的依据是一致的，利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。该方法基于的是蛋白质的疏水差异，蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。

一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。

5 分子筛层析

分子筛层析又称为凝胶层析或凝胶过滤。分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，.对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等，其中以葡聚糖凝胶应用最广。

凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。

6 蛋白分离纯化过程中的注意事项

由于蛋白质只有在其天然结构状态下才具有活性，才能具备相应的功能。因此，在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻注意维护它的稳定性，保护它的活性，无论进行何种层析，都需要注意以下方面：

1）生产过程中考虑操作温度，尤其是目的蛋白稳定性较差的样品，最好置于冰上或者在冷库内进行操作；即使是对温度不敏感的样品，也应控制操作温度不超过室温，温度过高会导致蛋白缓慢变性。

2）样品浓度要控制在一定范围内，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。

3）选用合适pH 的缓冲液，所使用的缓冲溶液pH 避免与蛋白质等电点相同，防止蛋白质的沉淀。

4）避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。

5）纯化用缓冲溶液的温度尽量控制稳定，温度过低则容易导致层析过程中产生气泡，温度过高则容易使蛋白质变性。

6）尽量保证各步分离纯化过程紧密相连，减少样品放置时间，因纯化过程为非无菌过程，如拖延时间过长，会导致样品中菌量增加，进而导致样品内毒素水平急剧升高。

7 展望

随着科学技术的不断发展，国家对药品监管力度的不断加强，以及生物制药领域市场竞争日益激烈，如何更好更快的将目的蛋白提纯就愈发显得重要，不仅要求纯化收率的提高，更要保证分离纯化的纯度和质量。现在针对不同产品、不同蛋白质研发其专属的、特异性的层析技术、层析介质就成为蛋白质分离纯化领域一个重要的发展方向。