刘立峰
（洞口县第二中学，湖南 洞口 422302）
1 目的和意义
1.1 邵阳市洞口县山区的雪峰山地区生长着一种野生经济植物——蕨(Pteridium aquilinum var.latiusculum)，属蕨类，凤尾蕨科，多年生草本。当地人称“蕨菜”，因富含营养，幼叶可食，并可用做中草药治疗疾病，具有很高的营养价值和经济价值，是洞口县山区野生植物多样性不可缺少的一部分。
1.2 随着环境对栽培蔬菜的污染与“绿色食品”的兴起，使野生蔬菜受到邵阳市们普遍青睐。蕨也不例外，蕨菜制品成了人们餐桌上的佳肴。山区人们由于经济的需求，无计划地大量采摘野生蕨出售，多年来对这种野生植物的人为破坏越来越严重。据调查，洞口县野生蕨的蕴藏量大约有6.4 万公斤，但现在许多地区野生蕨已很少见，洞口县蕨菜收购量大幅下降也证明了资源的日趋减少，盲目地采摘与收购对自然资源的破坏令人担忧。
1.3 蕨类植物的繁殖主要依靠营养繁殖与孢子繁殖。洞口县的野生蕨由于受到气候的影响，孢子繁殖困难，通常利用地下茎进行营养繁殖，繁殖率低。人们食用的蕨菜是野生蕨的幼苗，采摘幼苗又破坏了地下茎，使得野生蕨的繁殖更加困难。有人提出警告：洞口县部分地区野生蕨已有灭绝的危险。面临这种现状，我们开展了，一些试验研究，试图通过组织培养和微繁殖保护，以提高它的繁殖能力，增加物种的丰富度，达到保护和合理利用的目的，同时也利于洞口县山区生物多样性的持续发展。
2 组织培养和微繁殖
2.1 材料的来源
2013 年11 月采自邵阳市洞口县府君山家植试验田。此时植株正值休眠期，将未萌动的地下茎移栽至花盆内，移入温室，使部分地下茎提前萌动。
2.2 外植体的灭菌方法
外植体先用少量洗衣粉做清洁处理，然后水流冲洗30 分钟，用滤纸将外植体表面水分吸净后再用HgCl2灭菌10 分钟，最后用无菌水冲洗5 遍。
2.3 第一阶段的工作，由2013 年12 月18 日开始
（1）制备3 种类型的培养基，MS 培养基作为基本培养基
1#MS+2.4D-2mg／L+NAA0.5mg／L
2#MS+2.4D-0.5mg／L+NAA0.1mg／L
3#MS+6BA2mg／L+NAA0.2mg／L+CH100mg／L
上述培养基中均加3%的蔗糖、0.8%的琼脂，pH 值为5.8。
（2）接种和培养
外植体取休眠期带顶芽的地下茎(长约3cm)，用外植体的灭菌方法灭菌后，在无菌条件下切成0.3～0.5cm 的带有顶芽的茎段和不带有顶芽的茎段，并分别接种在3 种不同的培养基上，置于25℃～28℃暗培养条件下培养。
（3）生长与分化
10 天后观察两种不同位置的茎段在3 种不同培养基上的发育状况(表1)。
将培养基上顶芽膨大且带有愈伤组织的茎段，转移到新鲜的2#培养基上，分别置于光照条件和非光照条件下继续培养，第20、40、60天时观察其生长情况(表2)。
2.4 第二阶段的工作，由2014 年1 月7 日开始
（1）制备2 种不同的培养基(仍以MS 培养基为基本培养基)
16#MS+6BAlmg／L+IBAlmg／L+活性炭1.5g／L
7#MS+6BA0.5mg／L+NAA0.1mg／L
上述培养基均加入2%的蔗糖、0.8%的琼脂，pH 值为5.8。
（2）接种与培养
外植体取在破休眠期已经萌发出地面的绿色幼嫩根状茎(无菌方法同上无菌条件下切成0.8～1cm 的带顶芽和不带顶芽的茎段，分别接种在2 种不同的培养基上，置于25℃-28℃光照条件下培养。
（3）生长与分化(表3)
表3 生长与分化
2.5 第三阶段的工作，微繁殖试验，由2014 年2 月20 日开始
（1）制备2 种不同培养基(仍以MS 培养基为基本培养基)。
16#(同上)
17#MS+KTlmg／L+蔗糖2%+琼脂0.8%pH 值5.8
（2）取在16#培养基上诱导形成的幼苗(不需再灭菌)，分别切成顶芽基部茎段(包括节间)、幼叶，分别接种在2 种不同培养基上，置于25℃～28℃光照条件下培养。
（3）生长与分化。30 天后观察，不同类型的外植体在16#培养基上变化不大，但都能保持绿色。在17#培养基上，茎段(包括节间)、幼叶也变化不大，只有已切去幼叶的顶芽基部形成了具有6～8 个小芽的绿色丛生芽。将丛生芽分割转至新的17#培养基上，又可形成新的丛生芽。2 周后丛生芽伸长，形成幼苗，继续培养4 周后可分化出白色的不定根，形成一株完整的试管苗，试管苗可在试管内培养2 个月而不更换培养基。
3 实验结果
3.1 通过实验可以看出，休眠芽不能作为外植体进行组织培养，无论在何种条件下，很难诱导分化成苗。打破休眠的带顶芽的幼茎是最好的外植体，16#、17#培养基是组织培养最有效的培养基。综合以上实验，我们可以总结一套野生蕨组织培养的最佳方案，形成完整的试管苗。
3.2 野生蕨可以在离体条件下形成幼苗，在200mL 的三角瓶内的完整试管苗生长2～3 个月不更换培养基，用这种微繁殖的方法，为野生蕨建立一种独立的保护系统。对其他濒临灭绝的植物也可以采用微繁殖的方法，建立保护系统。
4 收获和体会
4.1 野生蕨的组织培养，能够快速繁殖大量的蕨的试管苗，对保护野生资源，推广人工栽植蕨菜的生产有一定的意义。
4.2 通过参加生物实验小组的活动，我学会了科学研究的工作方法，激发了我对生命科学的研究兴趣，进一步认识到生物多样性是21 世纪人类最关心的问题。
