张华锋
摘要:从原理、特点及应用等方面对食源性微生物致病菌的免疫及分子检测新技术作一概述,期望为致病菌监测提供参考。
关键词:致病菌免疫学聚合酶链反应基因芯片
食品中的生物性污染无论是在发达国家还是发展中国家都是影响食品安全的最主要原因,致病性微生物是对消费者健康危害最大的食品安全问题。要确定食源性微生物致病菌在食物链中相关的食品,寻找预防食品污染的关键环节则依赖于对致病菌的监测能力和水平。
传统的检测方法无法对难培养或不可培养的致病菌进行检测,而且耗时费力,获得结果通常需要几天的时间,不能实现有效的监测、预防作用。因此,发展新的快速检测与鉴定食源性致病菌的方法是及时有效地控制和预防致病菌传播的前提。本文从原理、特点及应用等方面对食源性致病菌的免疫学及聚合酶链反应、基因芯片等检测新技术进行综述。
1. 免疫学检测技术
免疫学检测技术将抗原、抗体反应的特异性与酶的高效催化作用相结合,是一种可以定位、定性和定量的综合技术,具高专一性和高敏感度。
1.1 酶联免疫吸附检测(ELISA)。1971年Engvall建立了ELISA方法,它以酶或者辅酶作为标记物,标记抗原或者抗体,用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应,并且利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原或者抗体,使其固相化,在其中进行免疫反应和酶促反应。ELISA具有选择性好、结果判断客观准确、实用性强、样品处理量大等优点,弥补了经典化学分析方法和其他仪器测试手段的不足。但ELISA对试剂的选择性高,很难同时分析多成分;对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应;对分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。
1.2 免疫磁性分离技术。免疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面,与样品中被检致病菌发生特异性的结合,载有致病菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下,向磁极方向聚集,弃去检样混合液,使致病菌不断得到分离、浓缩。免疫磁性分离技术代替了常规的选择性增菌培养过程,可特异有效地将目的微生物从样品中快速的分离出来。
1.3 免疫胶体金技术。免疫胶体金技术起源于1971年Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法(IGS)观察沙门氏菌。其基本原理是以微孔滤膜为载体包被已知抗原或抗体,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合,再用胶体金结合物标记而达到检测目的。其特点是单份测定、简单快速、特异敏感、不需任何仪器设备和试剂,几分钟就可用肉眼观察到颜色鲜明的实验结果,并可保存实验结果。
2. 聚合酶链反应(PCR)检测方法
聚合酶链反应(PCR)是近十多年来应用最广的分子生物学方法,在食源性致病菌的检测中均是以其遗传物质高度保守的核酸序列设计特 异引物进行扩增,进而用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果。其中,依赖PCR的DNA指纹图谱技术、多重PCR检测技术(m.PCR)、定量PCR检测技术等应用最为广泛。
2.1 依赖PCR的DNA指纹图谱技术。依赖PCR的DNA指纹图谱技术是通过各种改进的PCR技术,使目标微生物的核酸经扩增后,产生多条DNA扩增片段(特异性和非特异性的),通过统计分析,找出某种微生物的特有条带,进行区别鉴定。
2.1.1随机引物扩增DNA多态 (RAPD)。随机引物扩增DNA多态性主要用于不考虑微生物核酸精确序列的情况下,比较微生物间的DNA指纹图谱差异,用于细菌种问的鉴定,Black等[8]将毛细管热循环仪及RAPD技术用于李斯特氏菌(Listeria Pirie)的鉴定,3h即可出结果。Louie等比较了核酸分型技术、RAPD和脉冲场凝胶电泳技术,用于李斯特菌的分型鉴定,结果显示后两种方法效果较好。但是RAPD的不足之处是需对大量的随机引物进行筛选,且有时扩增的条带不很稳定。
2.1.2 基因内重复性一致序(ERIC)的扩增。ERIC片段是存在于肠道细菌核酸中的重复DNA序列,长126bp,含有一段高度保守的中心反转重复序列,分布在细菌染色体的不同位点上且以不同的距离分隔,因此,以这些重复的DNA片段作为PCR扩增时引物的结合位点,使其被分隔的片段大量扩增,在凝胶电泳上形成一系列的条带,从而区分不同的肠道细菌。Versalovio等[10]曾用与ERIC重复序列互补的寡核苷酸片段作为引物及斑点杂交DNA探针来检测包括大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)等不同菌种间存在的特异DNA指纹图谱。与RAPD相比,此法引用的引物序列固定,结果的重复性更好。
2.2 多重PCR检测技术(m-PCR)。PCR技术已经运用于食品中单一致病菌的检测, 并得到一定程度的推广,但食品中往往含有多种致病菌。多重PCR的建立,实现了多种食源性致病菌的同时检测。M.PCR是指在同一个反应体系中,加入多对特异性引物,如果存在与各引物对特异性互补的模板,即可同时在同一反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段,实现了一次性检测多种致病菌的目的。
我国学者严笠等[13]应用m.PCR,在同一扩增体系中同时扩增了大肠埃希氏菌O157:H7(Escherichia coli 0157:H7)、沙门氏菌(Salmonella spp.)和志贺氏菌(Shigella spp.)特征性基因,最后通过凝胶电泳实现了这三种致病菌的的同时快速检测,取得理想结果。m.PCR既保留了常规PCR的特异性、敏感性,又减少了操作步骤及试剂。但也存在较明显的不足:扩增效率不高、敏感性偏低;扩增条件需摸索与协调;可能出现引物间干扰等。
2.3 定量PCR检测技术。定量PCR检测技术是对传统定性PCR技术的发展和补充,即在PCR反应体系中加入标记物,通过标记物的表达量,在定性的同时实现定量。
2.3.1 内标定量PCR。内标定量PCR采用终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,建立常规PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重显性极差。因此,无法直接从终点产物量推算出起始模板量,而加入内标后,可部分消除终产物定量所造成的不准确性,达到定量。
2.3.2实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR技术无须内标物,而是在反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,有效地解决了内标定量PCR只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值(每个反应内的荧光信号到达设定的域值所经历的循环数,Cycle threshold)计算,根据标准曲线得定量结果。实时荧光定量PCR将DNA扩增和分子杂交同步进行,且采用了闭管检测,扩增后无须电泳,自动化程度高,减少了污染的可能性,提高了检测的灵敏度和特异性。
3. 基因芯片技术
基因芯片(gene chip)是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵列。其检测致病菌原理为:相关细菌的特异性基因(如毒力基因、抗生素耐受基因) 和基因库中的rDNA序列设计玻片上的片断,这种方法可以快速、准确地检测和鉴定食物中的病原菌。
唐晓敏等利用此技术检测水中常见致病菌,与传统方法鉴定结果一致性为95%,并且对于一个未知菌落,可以在4h之内完成菌种判断,为快速检测与鉴定常见致病菌提供了有效的手段。
4. 讨论
免疫学方法,不需复杂仪器,所需设备简单、易操作。其中免疫胶体金快速诊断技术由于其无污染、便捷、灵敏、安全等特点逐渐有取代ELlSA等的检测方法的趋势,对致病菌的检测有着相当大的应用前景。但免疫学方法一般需提供数量较多的纯化细菌,或需对样品进行浓缩后收集,以提高单位体积的含菌量,从而较难在短时间内得到检测结果。许多快速检测方法,在应用过程中有其所长和不足。总体来看,快速检测方法在卫生检验方面目前尚存在有时定性与精确定量难以兼顾状况。另外,每一种免疫学检测模式都存在抗体与非抗原物质之间的非特异性反应,如检测中特异性抗体与细菌增菌液、培养过滤物(含葡萄球菌A/G蛋白)或食品中某些成分(如溶菌酶E、单宁物质等)的结合,从而产生假阳性反应。此外,待检抗原被样品中一些物质或其它优势菌群所掩蔽,会产生假阴性反应。为了避免这些误差,可设置对照实验进行证实。通常,可用合成肽或抗独特型抗体特异阻断IgG或用单抗特异性阻断的方法减少假阳性;针对假阴性结果可以加入定量抗原到样品中,以国际标准抗原样品为准,进行对照,以此减少假阴性结果。在致病菌的分子生物学检测方法方面,由于检样中存在死的致病菌、特异性DNA或RNA片段存在同源性和检样中存在不可培养微生物的情况等问题,常常造成PCR检测结果与常规方法相比,阳性率变高的现象,除存在不可培养微生物的情况外,均属于假阳性范畴,然而对假阳性问题,通常在实际食品检测工作中,PCR检测技术可作为大通量的快速检测技术,对其中出现的极少数的阳性样品,可采用传统的方法加以印证,即可解决假阳性的问题。另外,非特异性扩增产物的出现、引物二聚体的形成、甚至凝胶电泳上无扩增带,只出现一片模糊,也限制了PCR技术的应用,针对这些问题,结合热启动PCR和降落PCR有望进一步得到改进。目前,分子生物学方法是食源性致病菌检测方法的主要发展方向,尤其是DNA指纹图谱技术近年来得到快速发展。对于一种未知菌, 为了提高致病菌检出率、缩短检测时间、简化检测程序,一般先采用通用引物多重PCR技术鉴定出种、属,再用DNA指纹图谱技术进一步分型。而将生物芯片技术或多重PCR与荧光探针定量技术相结合,形成一套完整分子生物学方法,可使致病菌的检测逐步向灵敏度高、特异性强、重复性大、简易、经济的方向不断发展。
参考文献:
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