刘源，倪渐凤，李芳芳，尹先哲#

1南阳市第二人民医院肿瘤科，河南 南阳 473012

2南阳市第一人民医院肿瘤科，河南 南阳 473012

原发性肝细胞癌（简称肝癌）是常见恶性肿瘤，主要来源于肝细胞和肝内胆管上皮细胞，其中肝细胞肝癌占比超过90%[1-2]。原发性肝细胞癌恶性程度较高，由于肝细胞具有较强的代偿功能，因此，80%的患者确诊时已经处于中晚期，全球每年超过60万人死于肝癌，其中50%发生在中国，严重威胁中国居民的生命健康[3]。目前，手术切除是原发性肝细胞癌的首选治疗方法，但超过60%的原发性肝细胞癌患者术后出现了复发和转移，5年生存率不超过5%，因此，原发性肝细胞癌术后复发和转移成为肝癌治疗难点[4]。研究原发性肝细胞癌复发和转移的分子机制，寻找有针对性的治疗靶点，是目前肝癌防治的研究方向。靶向诱导肝癌细胞凋亡是一种比较理想的治疗方案，具有特异性强、效果好、不良反应少等特点，对肝癌的治疗具有很好的推广前景。

通过Oncomine数据库整合原发性肝细胞癌组织表达谱分析发现，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1）在原发性肝细胞癌中的表达明显上调，表明IGF2BP1可能在原发性肝细胞癌发生发展中起关键作用[5-6]。抑制IGF2BP1的表达，可能抑制原发性肝细胞癌细胞的增殖和转移能力，为原发性肝细胞癌的治疗提供了方向。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）可以从多个层面调控基因的转录和表达情况，参与机体各种生理生化的调控，与多种疾病的发生发展密切相关[7]。本研究探讨miRNA-196b靶向抑制IGF2BP1的表达对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响及可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

肝癌HepG2细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，miRNA-196b模拟物（mimics）和阴性对照均购自上海吉玛生物科技有限公司，DMEM培养基、胎牛血清均购自美国GIBCO公司，噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）购自美国Amresco公司，膜联蛋白V（AnnexinⅤ）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，Trizol提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自大连TaKaRa公司，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒购自宝成生物工程（大连）有限公司，细胞蛋白抽提试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司，鼠抗人IGF2BP1、鼠抗人caspase 3抗体均购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的亲和纯化山羊抗小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗、鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体均购自武汉艾美捷科技有限公司，NanoDrop 2000c型蛋白核酸检测仪购自美国Thermo公司，实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、流式细胞仪均购自美国Bio-Rad公司，BIO-RAD垂直电泳仪购自美国BD公司，凝胶成像仪购自美国UVP公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及转染方法采用含胎牛血清的DMEM培养液培养肝癌HepG2细胞，37℃、5%CO2培养，隔天换液，取对数生长期细胞进行实验。将miRNA-196b mimics和阴性对照转染至肝癌HepG2细胞，分别作为mimics-196b组和阴性对照组，未处理的细胞作为空白对照组，培养48 h收集细胞，进行相关检测。

1.2.2 RT-PCR法检测miRNA-196b和IGF2BP1 mRNA的相对表达量取3组细胞胰蛋白酶消化后，根据RNA提取试剂盒操作说明书提取总RNA，测定mRNA浓度和纯度，根据反转录试剂盒说明合成互补DNA（complementary DNA，cDNA），根据荧光定量RT-PCR试剂盒说明进行扩增。反应条件：95℃预变性30 s、95℃变性5 s、60℃退火44 s共40个循环，以GAPDH作为内参，采用2-△△Ct法计算miRNA-196b和IGF2BP1mRNA的相对表达量。miRNA-196b上游引物为5'-GCAGCACGCTAGGTAGTTTCC-3'，下游引物为5'-TATCGTTGTTCTCCACTCCTTGAC-3'；IGF2BP1上游引物为5'-CCTGCTGGCTCAGTATGGT-3'，下游引物为5'-GACATTCACCACTGCCGTCTC-3'；GAPDH上 游引物为5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3'，下游引物为5'-GGTATCCATCGCCATGCTC-3'。

1.2.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测IGF2BP1和caspase3蛋白的相对表达量取3组细胞胰蛋白酶消化后，采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤2次，加入蛋白抽提试剂冰浴2 h；离心后提取上清液，BCA法对蛋白浓度进行检测，调整蛋白浓度。每组加入1/5体积的5×结合缓冲液（binding buffer）进行变性，-80℃保存备用。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，将凝胶蛋白低温下转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。加入一抗[鼠抗人IGF2BP1抗体（稀释浓度为1∶1000）、鼠抗人 caspase 3 抗体（稀释浓度为 1∶1500）]，4℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗（稀释浓度为1∶1500）4℃孵育2 h，进行显色，用凝胶成像系统采集图像，以GAPDH作为内参，以目的条带与内参条带灰度值比值表示IGF2BP1和caspase 3蛋白的相对表达量。

1.2.4 MTT 法检测细胞增殖能力取3组细胞胰蛋白酶消化后，以5×103/孔的浓度接种于96孔板，每孔 200 μl，待细胞融合后每孔加入 50 μl的 MTT溶液，继续培养4 h，弃掉上清液，每孔加入200 μl的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），振荡摇匀，测定光密度（optical density，OD）值，计算细胞增殖率，细胞增殖率=（mimics-196b组OD值-阴性对照组OD值）（/空白对照组OD值-阴性对照组OD值）。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡情况取3组细胞胰蛋白酶消化后，转移至离心管内，离心弃上清，采用1×binding buffer调整细胞浓度为1×106/ml，根据细胞凋亡AnnexinⅤ-FITC/PI检测试剂盒说明书步骤，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对所有数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-196b和IGF2BP1mRNA相对表达量比较

3组细胞miRNA-196b和IGF2BP1mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。mimics-196b组细胞miRNA-196b相对表达量均高于阴性对照组细胞和空白对照组细胞，IGF2BP1mRNA相对表达量均低于阴性对照组和空白对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。空白对照组和阴性对照组细胞miRNA-196b和IGF2BP1mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 3组细胞miRNA-196b和IGF2BP1 mRNA相对表达量比较（±s）

表1 3组细胞miRNA-196b和IGF2BP1 mRNA相对表达量比较（±s）

注：a与阴性对照组比较，P<0.05；b与空白对照组比较，P<0.05

组别miRNA-196bIGF2BP1 mRNA空白对照组1.00±0.031.00±0.07阴性对照组0.96±0.120.94±0.10 mimics-196b组2.77±0.15a b0.66±0.04a b F值254.38917.964 P值0.0000.003

2.2 IGF2BP1和caspase3蛋白相对表达量比较

3组细胞IGF2BP1和caspase 3蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。mimics-196b组细胞IGF2BP1蛋白的相对表达量均低于阴性对照组和空白对照组细胞，caspase 3蛋白相对表达量均高于阴性对照组和空白对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）。空白对照组和阴性对照组细胞IGF2BP1和caspase 3蛋白的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

2.3 细胞增殖和凋亡情况比较

3组细胞OD值和细胞凋亡率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。mimics-196b组细胞OD值均低于阴性对照组和空白对照组细胞，细胞凋亡率均高于阴性对照组和空白对照组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05），但空白对照组和阴性对照组细胞OD值和凋亡率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表2 3组细胞IGF2BP1和caspase 3蛋白相对表达量比较（±s）

表2 3组细胞IGF2BP1和caspase 3蛋白相对表达量比较（±s）

注：a与阴性对照组比较，P<0.05；b与空白对照组比较，P<0.05

组别空白对照组阴性对照组mimics-196b组F值P值IGF2BP1 0.89±0.13 0.86±0.07 0.29±0.03a b 45.317 0.000 caspase 3 0.82±0.11 0.80±0.06 1.34±0.13a b 25.877 0.001

表3 3组细胞增殖和凋亡情况的比较（±s）

表3 3组细胞增殖和凋亡情况的比较（±s）

注：a与阴性对照组比较，P<0.05；b与空白对照组比较，P<0.05

OD值102.16±14.85 97.43±9.60 78.33±6.13a b 15.090 0.000细胞凋亡率（%）2.34±1.10 2.68±0.83 4.71±0.81a b 5.785 0.040组别空白对照组阴性对照组mimics-196b组F值P值

3 讨论

术后复发和转移是导致肝癌患者预后差、生存时间短的主要原因[8]，研究显示，多种因素可导致肝癌的复发和转移[9]。miRNA广泛存在于真核细胞内，长度为22～23个核苷酸，具有高度保守性，参与细胞增殖、分化和凋亡过程，在恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用[10]。miRNA仅占基因总量的1%～3%，却可对超过30%的基因表达进行调控，约50%的肿瘤组织内可检测到miRNA的表达，且结果具有可重复性，表明miRNA可能与肿瘤发生发展密切相关[11-12]。不同肿瘤的miRNA在肿瘤组织中的表达情况不同，如肿瘤组织中miRNA-10b和miRNA-21等的表达上调，而miRNA-518b、miRNA-17p和miRNA-205等的表达下调，且miRNA的表达具有组织特异性，可以据此追踪肿瘤的起源[13]。通过miRNA靶向调控mRNA表达水平，是一种新型分子靶向治疗方法。miRNA与mRNA的结合具有互补的特点，但也不是完全互补匹配。通过相关软件预测miRNA与mRNA是否结合，可以寻找抗肿瘤治疗的特异性靶点，多种预测价值较高的软件同时进行预测和分析，结果较为可靠。miRNA-196b位于第7号常染色体，在乳腺癌、淋巴瘤、白血病等肿瘤组织中低表达，其表达情况与肿瘤患者的预后密切相关[14-15]。本研究结果显示，miRNA-196b mimics转染后，肝癌HepG2细胞中miRNA-196b的相对表达量升高。

研究显示，IGF2BP1与miRNA-196b结合的稳定性最高，特异度和保守性也较好。IGF2BP1是胰岛素样生长因子RNA结合蛋白家族中的重要成员，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein，IGF2BP）可以高度特异性地与miRNA结合，并参与细胞的增殖、分化、代谢等过程[16]。IGF2BP主要表达于肿瘤组织，在正常组织中低表达甚至不表达。研究显示，IGF2BP1在肝癌、胃癌等组织中的表达水平较高，但具体的机制尚不清楚[17]。因IGF2BP1在正常组织中基本不表达，而在多种肿瘤和（或）肿瘤来源细胞中表达上调，可以将IGF2BP1确定为“癌胚”。研究显示，通过miRNA抑制IGF2BP1的表达后，肿瘤细胞的增殖能力受到抑制，而凋亡率增加[18]。因此，IGF2BP1可能作为诊断恶性肿瘤的特异性生物标志物。caspase家族是细胞凋亡的执行者，caspase 2、caspase 9等凋亡启动因子激活时，可导致caspase级联反应，激活下游caspase 3、caspase 6、caspase 7等凋亡执行因子，一旦激活caspase 3，细胞凋亡将进入不可逆阶段[19]。本研究发现，mimics-196b组细胞IGF2BP1mRNA和IGF2BP1蛋白的相对表达量均降低，caspase 3蛋白的相对表达量均增加，OD值降低且细胞凋亡率升高，表明miRNA-196b可能通过靶向抑制IGF2BP1的表达，抑制肝癌HepG2细胞的增殖并促进其凋亡。

综上所述，通过转染miRNA-196b mimics可以提高miRNA-196b的相对表达量，抑制IGF2BP1的表达，抑制肝癌HepG2细胞的增殖并促进其凋亡，其可能机制与miRNA-196b靶向调控IGF2BP1有关，为肝癌的靶向治疗提供一定的理论依据。