彭黎明，杨林

国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院内科，北京 100021

胃癌作为常见的消化道肿瘤之一，患者往往确诊时已处于晚期，经过传统手术、化疗、放疗，其5年生存率仍不到20%[1]。近年来，肿瘤免疫治疗取得突破性进展，主要归功于免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体修饰的T细胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）的显着临床疗效。免疫治疗不仅对其他治疗耐药的肿瘤产生疗效，而且能使传统治疗认为不可能治愈的播散性肿瘤获得长期临床缓解[2]。然而，仍有相当一部分患者对免疫治疗无反应，如抗程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）单抗单药三线治疗晚期胃癌的客观缓解率（objective response rate，ORR）为11%～12%，患者中位总生存期（overall survival，OS）为5.3～5.5个月[3-4]；单药二线治疗晚期胃癌的ORR为16%，患者中位OS为9.1个月，与标准的单药紫杉醇化疗（中位OS为8.3个月）相比，并无明显优势[4]。尽管单药联合化疗一线治疗晚期胃癌的ORR为60%，明显高于单纯化疗的25%～48%[5-6]，但并未转化为OS延长（12个月vs8.0～11.2个月）[6-7]。有效的免疫治疗依赖于免疫细胞（尤其是T淋巴细胞）摧毁肿瘤细胞的能力。免疫检查点抑制剂疗效微弱的原因可能与这些患者肿瘤组织周围浸润的淋巴细胞数量太少或活性太低有关[8]。过继性细胞免疫治疗（adoptive cell therapy，ACT）是将患者自体的免疫细胞如树突状细胞（dendritic cell，DC）、自然杀伤（natural killer，NK）细胞或T细胞进行体外扩增，然后回输至患者体内，从而发挥杀伤肿瘤细胞的作用。国外最早于1985年就开始应用ACT治疗恶性黑色素瘤[9]，直到2017年，两种CAR-T细胞被批准用于治疗儿童和成人B细胞肿瘤，成为肿瘤过继免疫治疗的里程碑事件。目前，常用的过继性T淋巴细胞免疫疗法主要包括回输细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer，CIK）细胞、肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）、CAR-T及T细胞受体改造的T细胞（T cell receptor engineered T cell，TCR-T）。

1 ACT 细胞种类及在胃癌中的研究进展

1.1 CIK

CIK细胞是将人外周血单个核细胞在体外由多种细胞因子共培育而获得的一群异质性细胞，其中，CD3+CD56+细胞为主要效应细胞，既具有T淋巴细胞强大的杀瘤活性，又具有NK细胞非主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex class，MHC）限制性杀瘤的特点，因此，其又被称为NK样T淋巴细胞[10]。关于CIK细胞的临床研究已在肝癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中开展[11-16]。DC是迄今为止已知的体内功能最强大的专职抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC），能有效刺激T细胞对异型抗原产生免疫应答。将DC与CIK于体外共同培养，既可促进DC的成熟，又可增强CIK细胞的杀瘤活性。共培养后的DC表面标志物CD40、CD80、CD86的表达比单纯DC培养时增加了1.2倍，CIK细胞的活性亦明显提高[17]。DC-CIK细胞能够在体外快速增殖，且抗瘤谱广，安全性好，因而得到广泛应用[18]。一项对比化疗联合DC-CIK与单纯化疗一线治疗晚期胃癌临床疗效的初步研究发现，化疗联合DCCIK治疗具有延长患者OS、无进展生存期（prog-ress free survival，PFS）及提高患者ORR的趋势，且安全性高；与单纯化疗相比，DC-CIK治疗后的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD56+、CD3+CD56+细胞数目及百分比均明显升高，差异显着[19]。一项前瞻性非随机对照研究发现，4组晚期胃癌患者分别接受替吉奥（S-1）单药、S-1+顺铂（SP）、DCCIK+S-1、DC-CIK+SP治疗，其疾病控制率（disease control rate，DCR）分别为 5.6%、33.3%、47.1%和76.9%，化疗联合DC-CIK组患者的PFS、OS情况均明显优于单纯化疗组；DC-CIK治疗后，63.3%的患者的外周血ctDNA突变数量及频率下降[20]，提示细胞毒性药物攻击肿瘤细胞后可引起肿瘤微环境发生改变[20]，进而使肿瘤抗原释放增加从而提供更多新的抗原表位，促进DC对抗原的呈递，这种相互作用可使肿瘤血管正常化[21]，从而使细胞毒性T细胞能够进入肿瘤组织。一项Ⅰ期临床研究采用于体外经派姆单抗（pembrolizumab）处理的DC-CIK治疗既往治疗失败的晚期实体瘤，发现其具有明显的抗肿瘤活性，γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）的分泌明显增加；31例患者中，7例患者达到部分缓解（partial response，PR），其中，6例患者缓解持续超过5个月，DCR为64.5%；20例患者发生治疗相关不良事件（adverse event，AE），2例患者发生3/4级AE（包括发热、寒战），所有治疗相关AE均是可逆和可控的[22]。CIK细胞与靶向药物及其他治疗在胃癌中的联合应用仍在探索中。

1.2 TIL

TIL是在肿瘤及其周围组织聚集的一群具有异质性的免疫细胞，包括T细胞、B细胞和NK细胞等。过继TIL疗法是将肿瘤组织周围具有肿瘤特异性的T细胞从免疫抑制的肿瘤微环境中分离后在体外扩增、加工，使T细胞数量增多、抗肿瘤活性增强，再回输至患者体内从而发挥特异性抗肿瘤作用。目前的研究方向是提高回输效应细胞的质量以及简化获得肿瘤特异性T细胞的方法。研究发现，输注TIL后肿瘤发生退缩是由靶向肿瘤特异性抗原（也称新抗原）的T细胞（即新抗原反应性T细胞）介导的[23]。同样，免疫检查点抑制剂发挥疗效也可能是通过这些新抗原反应性T细胞实现的[24-25]。富集这些新抗原反应性T细胞进行体外扩增和回输可能增加疗效。获得TIL需要进行肿瘤组织活检，这就限制了TIL的应用。PD-1和4-1BB可被用作新抗原反应性T细胞的标记物[26-27]，通过检测外周血淋巴细胞中PD-1的表达可以识别恶性黑色素瘤患者外周血中的新抗原反应性T淋巴细胞[28]，这就为采用非侵袭性方法进行T细胞为基础的个体化治疗提供了新的策略。此外，靶向新抗原的个体化疫苗可激活之前已存在的以及全新的新抗原特异性T细胞免疫[29]。这些经过肿瘤疫苗或免疫检查点抑制剂治疗后产生的肿瘤反应性T细胞的抗原特异性更强，有望进一步提高TIL治疗的临床疗效。上述研究多仅限于实验室阶段，一项在Clinical Trial注册的、评估TIL治疗实体瘤有效性和安全性的2期临床试验（NCT03935893）目前正处于患者招募阶段。

1.3 CAR-T

CAR-T疗法是利用基因工程技术将识别某种抗原分子的抗体可变区（scFv）基因序列与TCR的胞内区序列拼接后，通过逆转录病毒、质粒等载体转染至T淋巴细胞内，并表达融合蛋白[即嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）]于T细胞表面，再通过非MHC限制性的方式识别特定抗原，发挥杀伤肿瘤细胞的作用[30]。CAR-T至今已发展至第5代[31]，第一代CAR-T对肾癌[32]、卵巢癌[33]等实体瘤的疗效均不理想。关于第二、三代CAR-T对实体瘤的疗效也少有成功的报道，Morgan等[34]报道1例使用第三代CAR-T技术治疗1例结肠癌合并肝肺转移患者出现“细胞因子风暴”而导致死亡的严重不良事件。第四代CAR-T[35]使CAR作为一种载体表达CK，但是，对于CK的毒性，无法很好地预测和处理。第五代CAR-T在第四代CAR-T的基础上进行改进后，使T淋巴细胞仅在激活时释放CK，相对减少了CK的相关毒性。CAR-T疗法对非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病及多发性骨髓瘤等血液系统肿瘤有良好疗效[36]。目前，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的两款CAR-T产品均通过靶向B细胞表面CD19抗原用于治疗B细胞白血病，但CAR-T在实体瘤中的应用相对较少。目前，研究发现其主要原因包括以下3点：①CAR-T细胞进入实体瘤时需要克服缺氧、低PH值及营养供应缺乏的微环境[37]，此种肿瘤微环境会抑制CAR-T细胞的长期存活并发挥作用。②实体瘤的抗原特异性远高于血液系统肿瘤，在实体瘤中很难找到一个表达于所有肿瘤细胞的抗原靶点[38]，这也是目前CAR-T在实体瘤中应用的最大困难。③CAR-T细胞进入实体瘤需要趋化因子辅助，然而，研究表明，实体瘤微环境中的趋化因子与CAR-T不匹配[39]。虽然CAR-T在实体瘤中几乎未应用，但已有的动物实验和临床Ⅰ期试验结果显示，CAR-T细胞疗法治疗癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）阳性的消化道实体瘤患者具有较高的安全性，经多次输注CAR-T细胞后，部分患者的肿瘤明显缩小，大部分患者血清CEA的浓度明显降低[40-41]。另外，靶向CEA的CART联合IL-2[42]、靶向间皮素（mesothelin，MSLN）及其亚型的CAR-T[43-44]、靶向NKG2D[45]的CAR-T均在胃癌动物模型中具有明显的抗肿瘤活性。一些新的CAR-T相关试验及探索如双特异性T细胞衔接子基因编辑的T细胞技术（bispecific T cell engager T cell，BiTE-T）[46]、重新设计CAR-T成双靶点[47]、串联[48]及通用CAR-T[49]均在研究之中。但是，尚无已完成的胃癌相关CRA-T临床试验，目前已注册的与胃癌相关的CRA-T临床试验共10项（NCT02744287、NCT03960060、 NCT02713984、 NCT03941626、NCT03941626、 NCT02349724、 NCT02617134、NCT03563326、NCT03890198、NCT02725125），大部分试验仍处于受试者招募阶段。

1.4 TCR-T

随着基因工程的进步，针对过继细胞治疗靶向性不足的问题，研究人员对T淋巴细胞的T细胞受体（T-cell receptor，TCR）基因进行修饰或使其表达人工设计的抗原受体，从而提高T淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性识别和结合能力。早先的方法是使T细胞表达的TCR能靶向肿瘤中呈高表达但在正常组织中也能表达的肿瘤相关抗原，如MART-1、gp100、MAGE-A3和CEA等，其疗效和安全性均较差。研究发现，靶向纽约食管鳞状上皮癌抗原1（New York-esophageal squamous cell carcinoma 1，NY-ESO-1）的高亲和力的TCR-T疗法在转移性或复发的黑色素瘤、滑膜肉瘤或骨髓瘤中的反应率分别为55%、61%，且无严重不良反应，有可能成为第一个被批准用于临床的转基因TCR-T产品[50-51]。研究发现，新抗原反应性T细胞才是主要的效应细胞，因此，TCR研究的方向集中到了针对新抗原而非自身抗原[23]。靶向新抗原的TCR-T有更高的选择性和亲和力，有可能增强抗肿瘤效应，且不良反应更少。然而，TCR-T和TIL的杀瘤效应是MHC限制性的，MHC分子在肿瘤细胞中的表达通常被下调，因此，限制了其发挥疗效。目前，在Clinical Trial注册的实体瘤TCR-T临床试验共有25项，其中，与胃癌有关的5项研究均处于招募阶段（NCT03941626、NCT03139370、 NCT03686124、 NCT02650986、NCT03190941）。

2 ACT 治疗胃癌存在的问题及可能的解决措施

相比于血液系统肿瘤，ACT疗法在胃癌及其他实体瘤中面对的障碍更多、更复杂。首先，输注的T细胞必须能到达并浸润至肿瘤组织中。到达肿瘤组织后，T细胞还面对着一个免疫抑制的环境，其中包括免疫抑制细胞（如调节性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞等）、乏氧、坏死、营养缺乏以及一系列免疫抑制分子[如程序性死亡受体配体 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）][52-53]。此外，肿瘤患者的肿瘤环境或引流淋巴结中具有免疫调节活性的多种酶如精氨酸酶1、诱生型一氧化氮合酶、吲哚胺2,3双加氧酶（indoleamine 2,3 dioxygenase，IDO）等的表达发生上调，这些均会导致T细胞活化不足和（或）T细胞抑制，使肿瘤特异T细胞效应在循环中和肿瘤组织中不能持久，从而限制ACT的疗效。此外，若肿瘤持续存在，持续的抗原暴露可导致内源性T细胞耗竭。最后，即使T细胞能在免疫抑制的肿瘤环境中存活并维持其效应功能，肿瘤抗原或抗原呈递途径中的成分丢失可导致抗原阴性的肿瘤大量生长从而发生免疫逃逸。克服上述障碍的策略：①优化过继性T细胞的结构，增加T细胞在肿瘤组织中的穿透性，提高T细胞在肿瘤或血液循环中的扩增能力，并增加其持久性[54]，或富集具有干细胞特征的T细胞，缩短体外扩增时间，并与细胞因子或抗原共同培养，延迟T细胞分化，增加持久性[55]。②由于输注的肿瘤特异性T细胞会上调共抑制受体如PD-1、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（T cell immunolobulin and mucin-containing protein-3，TIM-3）、淋巴细胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）和CD200的表达，而肿瘤细胞可通过T细胞活化介导的辅助性T细胞1（helper T cell 1，Th1）细胞因子的释放产生共抑制配体，如PD-L1。CAR-T疗法和免疫检查点抑制剂（多为PD-1/PD-L1）联合治疗可能是一种避免免疫抑制的方法[56]。通过基因编辑技术[57-58]去除T细胞上PD-1基因的相关临床研究正在进行（NCT03399448）。靶向纤维母细胞活化蛋白（几乎表达于所有实体瘤细胞）的CAR-T亦正在进行临床研究[59]。③对T细胞进行修饰使其能产生白细胞介素-15（interleukin-15，IL-15）等细胞因子，表达CD40L等共刺激配体，或分泌阻断检测点的单链可变区片段（single-chain variable fragment，scFv）等。这些新的基因工程T细胞被称为通用细胞因子介导杀伤的重定向T细胞（T cell redirected for universal cytokine-mediated killing，TRUCK）或“武装的”T细胞，可以保留T细胞强大的杀瘤活性，并提高持久性。④针对新抗原的特异性T细胞能够减少毒性，增加疗效[60]。然而，实体瘤的CAR-T多靶向肿瘤相关抗原，可设计具有适当亲和力的CAR变异体，能根据靶抗原表达水平的不同区分肿瘤细胞和正常细胞[61]。低亲和力的CAR可对高表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞产生强烈的细胞毒效应，而对低表达肿瘤相关抗原的正常细胞，其毒性轻微或无毒性[62-63]。采用基因编辑技术破坏细胞表面TCR[防止移植物抗宿主排斥反应（graft ver-sus host reaction，GVHR）]和β2微球蛋白（beta 2 microglobulin，β2M）或HLA-I分子（防止移植排斥反应）的表达[57,64-65]，可实现同种异体T细胞的输注，用于淋巴细胞缺乏或身体状况差的患者。

3 小结与展望

近年来，ACT尤其是TCR-T、CAR-T治疗肿瘤的研究进展很快，在某些肿瘤中已显示出很好的疗效，但对实体瘤的疗效仍有限。如何增加效应T细胞的功能、优化T细胞的生产、减少临床毒性与T细胞耗竭及避免肿瘤微环境的免疫抑制以达到临床应用是ACT研究需要迫切解决的问题。免疫治疗是目前肿瘤治疗的手段之一，将来有可能成为肿瘤治疗的基本手段。未来的方向可能是根据胃癌肿瘤微环境中不同的免疫状态给予不同的免疫治疗策略，例如：对于肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）高的患者，可考虑选择免疫检查点抑制剂和TIL[24]；对于TMB低的患者，可考虑高亲和力的TCR-T；若有合适的肿瘤表面标记，则可考虑CAR-T。在免疫治疗的基础上联合其他治疗手段如化疗、靶向治疗、放疗等有望成为将来肿瘤治疗的最佳策略。