秦 凯，程 熠，黄露露，袁响林
（华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科，湖北武汉430030）
我国癌症中心最新报告指出［1］，宫颈癌位居中国恶性肿瘤发病率的第八位，且在女性恶性肿瘤中的发病率（2.83%）仅次于乳腺癌，位居第二。尽管早期筛查、手术治疗、放化疗、靶向治疗等均被证实可有效降低宫颈癌的发病率和死亡率，但是迄今为止，该病的5年生存率为67.6%，仍未达到理想目标，尤其是晚期患者，5年无疾病生存率仅为50%［2］，因此，寻找治疗宫颈癌的新靶点尤为重要。
近年来，肿瘤与免疫的相关性研究呈爆发式进展，目前国内外较为公认的“免疫逃逸”学说成为肿瘤发生与发展的重要机制之一，基于该机制而采取的程序性死亡受体1/程序性死亡受体⁃配体1（PD⁃1/PD⁃L 1）免疫疗法成为人类恶性肿瘤治疗史上的一次革命。研究证实［3］，约95%的宫颈癌患者可能由持续感染人乳头瘤病毒所引起，而人体免疫系统在感染应答过程中扮演重要角色，为该病的免疫治疗奠定了基础；还有研究显示［4］，约80%的宫颈鳞状细胞癌患者存在PD⁃L 1高表达的情况，这使得宫颈癌成为PD⁃1/PD⁃L 1免疫疗法的主要候选疾病之一。但是在KEYNOTE⁃158（NCT 02628067）研究中［5］，帕博丽珠单抗应用于晚期宫颈癌患者的总体客观缓解率（ORR）仅为12.2%，其中PD⁃L 1阳性者ORR为14.6%，而PD⁃L 1阴性者免疫治疗均无效。因此，筛选宫颈癌免疫治疗的获益人群是提高ORR和改善预后的有效措施之一。肿瘤中发生浸润的免疫细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，其浸润模式与临床结果存在一定相关性，并可能成为药物靶标来提高生存率，因此，分析宫颈癌浸润性免疫细胞的组成特点，以及浸润模式与临床特征和预后的相关性，有利于临床筛选宫颈癌免疫治疗的获益人群。本研究应用Cibersort软件对公共数据库癌症基因组图谱（TCGA数据库）中宫颈癌患者的基因表达数据和临床数据进行分析，以期为进一步提高宫颈癌的生存率奠定基础。
1 资料与方法
1.1 数据来源
从公共数据库癌症基因组图谱（the cancer ge⁃nome atlas，TCGA，https：//cancergenome.nih.gov/）中下载所有宫颈癌基因表达数据共309例，其中包含宫颈癌组织306例、正常宫颈组织3例，并下载相关临床数据，包括年龄、临床分期、肿瘤分级和生存状态等。
1.2 数据处理方法
1.2.1 计算宫颈鳞状细胞癌中浸润性免疫细胞的组成 安装perl软件并将基因表达数据整理成行名为基因名、列名为样品名的矩阵，提取获得宫颈癌组织和正常组织转录本的mRNA表达谱数据，使用R语言limma包、BiocManager包将表达谱矩阵校正，用Cibersort软 件（http：//cibersort.stanford.edu/）来计算每个肿瘤组织中M 1巨噬细胞、M 2巨噬细胞、M 0巨噬细胞、滤泡辅助性T细胞、中性粒细胞等共22种浸润性免疫细胞类型的相对比例。为进一步提高精度，以Cibersort软件中P<0.05为标准进行样本筛选，筛选出有意义的样本后，利用R语言及相应包绘制样本中每种免疫细胞的柱状图（即宫颈癌及正常样本中各种免疫细胞占比）、相关性热图（即宫颈癌组织样本中每种免疫细胞占比的相关性）和小提琴图（即可视化免疫细胞在宫颈癌及正常组织中的分布）。
1.2.2 评估宫颈癌免疫细胞浸润模式与临床特征和预后的相关性 将上述转录本数据结合临床数据，评估宫颈癌免疫细胞浸润模式与临床特征（年龄、临床分期、肿瘤分级）的预后的相关性。
1.3 统计学处理
使用R语言（3.6.1版本）和Bioconductor（https：//www.bioconductor.org/）进行统计学分析。对于丢失的数据，则应用列表删除法进行处理，如果缺少任一单个值，则将该样本整体排除。以R语言中的corrplot包绘图进行不同免疫细胞间相关性的检测；采用Perl分析宫颈癌免疫细胞浸润模式与临床特征的相关性；再根据免疫细胞水平中位值将患者分为高、低浸润组，应用R语言中的survival包，通过K⁃M Log⁃Rank法计算其与生存的相关性，并绘制图形。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 宫颈癌样本的临床病理特征
307例宫颈癌样本中，年龄>50岁119例（38.8%），≤50岁188例（61.2%）；临床分期为T 1者141例（46.0%），T 2者72例（23.4%），T 3者21例（6.8%），T 4者10例（3.3%），未知63例（20.5%）；肿瘤分级为G1者18例（5.9%），G2者136例（44.3%），G3者120例（39.1%），G4者1例（0.3%），GX者24例（7.8%），未知8例（2.6%）；生存状态为存活237例（77.2%），死亡70例（22.8%）。
2.2 宫颈癌组织浸润免疫细胞情况
采用Cibersort评估了306例宫颈癌和3例正常组织免疫细胞的分布情况，利用R语言及相应包绘制的柱状图、相关性热图和小提琴图分别如图1～3所示。
图1 宫颈癌及正常样本中各种免疫细胞占比的柱状图Fig 1 Histogram of the proportion of 22 immune cells in all samples
图2 宫颈癌组织样本中每种免疫细胞占比相关热图Fig 2 Correlation heatmap of the proportion of each immune cell in cervical cancer samples
图1和图3显示，宫颈癌肿瘤组织与正常组织相比，静息状态树突细胞、活化的树突细胞、M 1巨噬细胞及活化的CD4+记忆性T细胞含量较高；M 2巨噬细胞、中性粒细胞、调节性T细胞及活化的肥大细胞含量较低。图2显示，在宫颈癌组织中，构成比相关系数较大的免疫细胞包括：M 0巨噬细胞与活化的肥大细胞（0.54），活化的肥大细胞与静息状态树突细胞（0.60）；静息状态树突细胞与活化的树突状细胞（−0.55）。
图3 宫颈癌及正常组织中免疫细胞构成比小提琴图（蓝色：正常组织；红色：子宫颈癌）Fig 3 Violin plots of immune cells in cervical cancer and nor mal tissues（Blue：normal tissues；Red：cervial cancer tissues）
2.3 宫颈癌免疫细胞浸润模式与临床特征的相关性
2.3.1 与年龄的相关性 根据年龄是否大于50岁进行分层分析，结果显示，M 1巨噬细胞、未活化的CD4+记忆性T细胞、γδT细胞的含量与患者年龄呈正相关，差异有统计学意义（P<0.05）；滤泡辅助性T细胞、活化和未活化的自然杀伤（NK）细胞和幼稚CD4+T细胞的含量与患者年龄呈负相关，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。
图4 宫颈癌各免疫细胞含量与年龄的相关性Fig 4 The correlation between the content of immune cells in cervical cancer and age
2.3.2 与临床分期和肿瘤分级的相关性 根据临床分期和肿瘤分级进行分层分析，结果显示，各免疫细胞含量与临床分期和肿瘤分级之间，均无显着相关性（P>0.05）。
2.4 宫颈癌免疫细胞浸润模式与预后的关系
根据各免疫细胞构成比中位值高低，采用K⁃M Log⁃Rank法计算其与生存的相关性，结果显示，静息状态树突状细胞和滤泡辅助性T细胞构成水平对患者生存有明显影响（P<0.05），其中，静息状态树突状细胞构成比高者总生存期短，而滤泡辅助性T细胞构成比高者总生存期长，见图5。
图5 免疫细胞构成水平的K⁃M生存曲线Fig 5 K‑M sur vival curve of the level of immune cell composition
3 讨论
既往大多用免疫组化法或流式细胞术来分析肿瘤组织免疫细胞的浸润模式，程序繁琐、回馈效率低，本研究采用的Cibersort软件由斯坦福大学医学院的研究人员Newman等于2015年发明，该软件采用了反卷积算法，可准确、快速地分析复杂组织的基因表达谱数据，优势明显［6］。本研究首先基于TCGA数据库中宫颈癌患者的基因表达数据和临床数据，对宫颈癌浸润性免疫细胞的组成特点进行了统计分析，结果显示，与正常组织相比，宫颈癌肿瘤组织中，静息状态树突细胞、活化的树突细胞、M 1巨噬细胞及活化的CD4+记忆性T细胞含量较高，而M 2巨噬细胞、中性粒细胞、调节性T细胞及活化的肥大细胞含量较低，且有3对免疫细胞之间的构成比相关系数较大，说明这些免疫细胞参与了宫颈癌的发生与发展，且与其他恶性肿瘤相似，宫颈癌组织中免疫细胞的组成存在一定的特异性，可为该病的早期筛查与诊断提供参考。
进一步对宫颈癌组织中免疫细胞浸润模式与临床特征的相关性进行分析，结果显示，M 1巨噬细胞、未活化的CD4+记忆性T细胞和γδT细胞的含量与患者年龄呈正相关，滤泡辅助性T细胞、活化和未活化的NK细胞和幼稚CD4+T细胞的含量与患者年龄呈负相关，但是各免疫细胞含量与临床分期和肿瘤分级之间均无显着相关性，这一结果预示，免疫细胞浸润模式检测并不能用于判断宫颈癌的临床分期和肿瘤分级，而年龄可能是影响组织免疫细胞浸润模式的重要因素之一。随着年龄的增长，肿瘤在不断进展的过程中，免疫细胞浸润模式在发生着转变。依据功能的不同，巨噬细胞可分为M 1巨噬细胞和M 2巨噬细胞两种类型，前者由M 0巨噬细胞受干扰素（IFN）⁃γ刺激活化形成，主要参与炎症反应及抗肿瘤细胞的免疫应答过程，具有显着的抗肿瘤生成作用，后者则具有激活肿瘤细胞增殖的作用，可促进肿瘤生长［7］。本研究中M 1巨噬细胞与患者年龄呈正相关，说明随着年龄的增长，体内M 1巨噬细胞大量增殖，以发挥抗肿瘤进展的作用。其次是CD4+记忆性T细胞。有研究证实［8］，活化的CD4+记忆性T细胞可通过调节IFN⁃γ、肿瘤坏死因子⁃α和白介素⁃2等的合成与释放来控制宫颈癌肿瘤细胞的增殖，因此高水平的活化CD4+记忆性T细胞与较高的生存率相关，说明该类型细胞的浸润通常可预示肿瘤的良好预后，而未活化的CD4+记忆性T细胞由于受到严格的调控而几乎不能表达与IFN⁃γ、肿瘤坏死因子⁃α和白介素⁃2等合成与释放相关的基因，可能与较差的预后相关。最后是γδT细胞可产生IFN⁃γ和肿瘤坏死因子⁃α等抗肿瘤因子，从而发挥显着的抗肿瘤作用，有利于预后改善［9］，本研究中γδT细胞含量与年龄呈正相关，说明年龄越大，患者体内的γδT细胞增殖越快，以达到控制宫颈癌进展的目的。
最后对宫颈癌组织中免疫细胞浸润模式与预后的相关性分析结果显示，静息状态树突状细胞构成比高者总生存期短，而滤泡辅助性T细胞构成比高者总生存期长，说明这两种免疫细胞在宫颈癌的预后预测中具有一定应用价值。其中，滤泡辅助性T细胞在机体免疫反应过程中起到关键作用，其分化过程由多种因子参与［10］。国内外学者已证实该细胞可作为多种恶性肿瘤免疫应答的关键调节因子。在卵巢癌患者中，含T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域分子3（TIM⁃3）主要在Pd⁃1阳性的滤泡辅助T细胞中表达，而TIM⁃3在肿瘤浸润淋巴细胞中的含量明显高于外周血，具有诱导B细胞分泌IgM、IgG和IgA的功能，从而调节肿瘤免疫［11］。欧阳燕等［12］的研究发现，高水平的滤泡辅助性T细胞与胃癌患者较长的总生存时间相关。还有一项研究对乳腺癌患者进行调查，结果显示，滤泡辅助性T细胞在肿瘤组织中的基因印迹与生存期呈正相关［13］。本研究中，滤泡辅助性T细胞含量与患者年龄呈负相关，而且泡辅助性T细胞构成比高者总生存期长，说明该细胞可作为宫颈癌的预后预测指标。树突状细胞是人类免疫系统中功能最强的特异性抗原提呈细胞，能够激活肿瘤免疫治疗中的T细胞。de Azevedo⁃Santos等［14］发现自乳腺癌患者和健康供者的树突状细胞的表面表型、细胞因子分泌模式和淋巴细胞刺激活性存在明显差异。但是目前，静息状树突细胞在肿瘤中的作用研究相对较少，需进一步通过临床研究加以证实。
综上所述，通过Cibersort软件对宫颈癌浸润免疫细胞组成进行生物信息学分析，可为免疫细胞与宫颈癌的相关性研究提供新的线索和依据：免疫细胞参与了宫颈癌的发生与发展，且与正常组织相比，宫颈癌组织中免疫细胞的组成存在一定的特异性，可为该病的早期筛查与诊断提供参考；不同年龄段患者可能存在不同的免疫细胞浸润模式，临床可以此为基础，探索药物靶标，并进行有针对性地治疗来提高生存率；静息状态树突状细胞和滤泡辅助性T细胞在宫颈癌的预后预测中具有一定应用价值，可作为宫颈癌临床免疫治疗可能的疗效预测指标。
