柳青，邱广斌，翟如波△（中国人民解放军第二○二医院检验科，沈阳 0003）
龟分枝杆菌是一种常见的环境腐生物寄生菌，广泛分布于自然界，是分枝杆菌医源性感染最常见的菌种之一，可引起脓肿、肺部以及伤口感染，主要通过污染的水或手术器械传播［1］。近年来，由非典型分枝杆菌引起的感染日益增多，国内由于对此病的认识不够，检查和鉴定方法都较局限，依靠常规治疗结核病的药物效果一般都不好，使得治疗比较困难［2］。因此，及时、正确的鉴定该菌对临床治疗、控制医院内的感染流行具有重要意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料患者，男，61岁，2013年5月因无明显诱因周身红斑、浮肿加重，伴发热，体温最高37.8℃，自行静脉应用头孢哌酮、地塞米松（剂量不详）7d，但发热症状无缓解，继而出现四肢皮肤红肿加重，耻骨联合处、左小腿出现水疱，水疱破溃后形成溃疡，来该院就诊。入院时一般状态差，双肺听诊呼吸音弱，右下肺可闻及散在帛裂音，全身皮肤多处硬结、红肿及溃疡，其中硬结以上腹部较明显，约6cm×6cm，红肿处皮温高，无破溃，无压痛，以双前臂、双腋和两侧腹部较严重，溃疡以耻骨联合处和左侧小腿内侧处较重（左小腿内侧可见一大小约16cm×9cm 创面，表面结少量灰黑色痂皮，有少量渗出，周围皮肤略有红肿，耻骨联合处可见一大小约12cm×7cm 创面，下连至会阴部，部分皮肤软组织缺失，渗出较多，周围皮肤无明显红肿，骶尾部可见1cm×1cm 溃疡）。左侧腋下、左侧腹部靠近髂部红肿处可见内有脓样液化，触之内有波动感。胸部CT 显示：双肺纹理增粗、紊乱，呈网状及毛玻璃状改变。B 超检查提示：有局限性脓肿。病理检查提示：有结核样肉芽肿。微生物学检查：多次送检血培养呈阳性，涂片进行革兰染色为革兰阳性杆菌，抗酸染色为阳性。
1.2 仪器与试剂血琼脂、麦康凯、营养琼脂、M－H 琼脂、噻吩－2－羧酸肼（TCH）培养基、对硝基苯甲酸（PNB）培养基、7H12B培养基、5μg／mLα－硝基－α－乙酰氨基－β－羟基苯丙酮（NAP）、硝酸盐等微量生化管。
1.3 方法血液经增菌培养后接种于血琼脂、麦康凯、营养琼脂，菌落偶有粗糙型，营养要求不高，普通血琼脂、麦康凯培养基均可生长。在普通血琼脂培养基上35℃培养2～5d可见明显菌落。菌落为无色、圆形、光滑、湿润、凸起。菌落涂片革兰染色为阳性，抗酸染色阳性。再传代培养于噻吩－2－羧酸肼（TCH）培养基和对硝基苯甲酸（PNB）培养基上生长良好；传代于7H12B培养基内，24h可见絮状生长；传代于变色液体培养基内，24h培养基即可变紫色或红色，且有紫色菌体沉淀；能耐受5μg／mLα－硝基－α－乙酰氨基－β－羟基苯丙酮（NAP），由此可确定为快速生长分枝杆菌（RGM）。确定后进行芳香硫酸酯酶（3、14d）试验、硝酸盐还原试验、铁吸收试验、麦康凯琼脂生长试验和30℃、37℃、45℃试验。除了龟分枝杆菌（类龟分枝杆菌除外）外，其他快速生长分枝杆菌硝酸盐还原试验和铁吸收试验均为阴性［3］；除了耻垢分枝杆菌和偶发分枝杆菌Ⅰ型外，其他快速生长分枝杆菌45℃均不能生长；除了耻垢分枝杆菌芳香硫酸酯酶（3d）阴性外，其他快速生长分枝杆菌均为阳性；除了部分龟分枝杆菌龟亚种外，其他均能在麦康凯琼脂培养基上生长，由此鉴定为龟分枝杆菌。
2 结果
2.1 涂片结果血培养提示阳性，将集菌处理后的培养物涂片，进行革兰染色，镜下可见革兰阳性杆菌。同时进行抗酸染色，镜下可见抗酸阳性杆菌，见图1、2。
图1 血标本革兰染色涂片
图2 血标本抗酸染色涂片
2.2 培养结果用无菌注射器从阳性血培养瓶中，抽取适量血液，接种于血平皿、麦康凯培养基中，置于35℃温箱内，培养3～5d。血平皿上菌落为无色、圆形、光滑、湿润、凸起。见图3。
2.3 药敏结果选用纸片琼脂扩散法。培养板在35℃中孵育3～5d，由于药物不稳定性，孵育时间不能超过5d，结果显示，阿米卡星抑菌环为30mm，环丙沙星抑菌环为20mm，四环素抑菌环为30mm，庆大霉素抑菌环为20mm，第3代头孢抑菌环为6mm，克拉霉素抑菌环为15 mm，利福平抑菌环为18mm。推测阿米卡星、庆大霉素、克拉霉素、四环素敏感，环丙沙星、利福平中敏，头孢菌素耐药。从而判定此菌是一种对多种抗菌药物耐药的细菌，药物敏感性差异较大。
图3 血平皿上菌落形态
3 讨论
龟分枝杆菌为非结核分枝杆菌（NTM）Runyon 分类法的第Ⅳ群——快速生长菌（又名快速生长分枝杆菌）。该细菌广泛存在于土壤和灰尘中，为环境中最常见的分枝杆菌。菌体为微弯曲或直的杆菌，不同条件下，菌体呈多形态性，革兰染色不明显，多数情况下为阳性；无荚膜鞭毛不能运动，幼龄菌具有较强的抗酸性，随着菌龄延长抗酸性减弱；最适生长温度为25～37℃，能引起局部及全身感染。本菌营养要求不高，在血平皿、麦康凯、营养琼脂上，35℃均可生长。此菌对一线抗结核药物的耐药性较高，所以临床上大都采用联合用药。本例患者采取阿米卡星、克拉霉素、头孢西丁、利福平联合用药，并对脓肿部位进行清创治疗。治疗一段时间后胸部CT 显示双肺纹理较以前清晰，B超检查提示局限性脓肿缩小，微生物学检查表明多次送检血培养呈阴性。
随着流行病学调查，快速生长分枝杆菌的分离率、临床感染率和发病率总体上呈逐渐增多的趋势，占分枝杆菌菌株总数的20%左右，与医院感染密切相关［4－6］。此类细菌以龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌为代表。本例患者确诊感染龟分枝杆菌，此菌对人类的致病性不高，经常是在机体免疫功能低下，或作为继发性、伴随性疾病发生。感染具有条件性是此菌致病性的一个显着特点，往往在慢性阻塞性肺病、免疫缺陷或免疫抑制剂、长期激素使用者、脏器移植、肿瘤、老年人中高发。本例患者就是因患有免疫系统疾病，长期使用免疫抑制剂，导致免疫缺陷，进而继发龟分枝杆菌感染，导致败血症。
综上所述，快速生长分枝杆菌感染及发病，由于耐药率高以及广泛，导致临床可供选择的药物较少，因而给治疗带来很大的困难［7－10］。所以加强实验检测，及时、准确鉴定该病原菌，给临床用药提供理论支持，临床根据药敏试验结果，组合有效的治疗方案，才能更好地控制该疾病。
［1］陈升汉.快速生长分枝杆菌病的诊断和治疗［J］.中华结核和呼吸杂志，2000，23（5）：273－274.
［2］邹晓艳，杨德远，杨玲.从脓肿及病变组织中检出龟分枝杆菌［J］.微生物与感染，2013，8（2）：96－97.
［3］叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.3版.南京：东南大学出版社，2006：10.
［4］许蕴怡，李冰，谭耀驹，等.广州地区临床分离非结核分枝杆菌菌种鉴定及耐药结果分析［J］.广东医学，2011，32（3）：334－336.
［5］刘厚明，詹能勇，陈建波，等.145株非结核分枝杆菌对10种药物的耐药性分析［J］.临床肺科杂志，2011，16（9）：1390－1392.
［6］李昕洁，谭守勇，黄业伦，等.812株非结核分枝杆菌临床分离株流行病学特征分析［J］.中国防痨杂志，2010，32（12）：132－133.
［7］吴龙章，陈素颖，曾少芳，等.广州市12年间分枝杆菌菌型与药物敏感性结果变迁的分析［J］.中华预防医学杂志，2011，45（1）：26－29.
［8］王俊玲，汪志慧，尹诗维.112例非结核分枝杆菌药敏耐药分析［J］.医学检验与临床，2011，22（4）：62－63.
［9］卢家泽，李德宪.51例非结核分枝杆菌肺病的临床分析［J］.广东医学，2010，31（19）：2569－2570.
［10］陈华，陈品儒，肖芃.180株Ⅳ群非结核分枝杆菌分布及耐药性分析［J］.广东医学，2011，32（11）：1433－1435.
