杜 军，李忆军
（湖南省津市市人民医院药剂科，湖南津市 415400）
拉莫三嗪（1amotrigine，LTG）为一种新型的广谱抗癫痫药，对部分性发作、GTCS、Lennox-Gastaut综合征、失神发作和肌阵挛发作有效，临床上用于难治性癫痫的辅助治疗[1-3]。由于其半衰期较长（24～30 h），可以每日1次给药。苯巴比妥（phenobarbital，PBT）常作为小儿癫痫的首选药物，广谱，起效快，对GTCS疗效好，也用于单纯及复杂部分性发作，对发热惊厥有预防作用[4-5]，半衰期长达37～399 h。上述药物的治疗范围窄，且抗癫痫效果、药物不良反应与药动学特征有关。为了评价疗效或确定给药方案，使给药方案个体化，以提高药物治疗水平，达到临床安全、有效、合理的用药。因此开展治疗药物监测有重要临床意义。本研究在文献[2-6]的基础上进行改进，采用以氯硝西泮（Clonazepam，CNZ）为内标，建立了HPLC法同时测定两者的浓度，为临床合理用药提供依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent高效液相色谱分析仪（美国Agilent公司）；低温高速离心机（德国Beckman公司）；KQ50B型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；XW-80A漩涡混和器（上海医科大学仪器厂）；电子分析天平（AG285型，瑞士梅特勒-托利多公司）。
1.2 试药
LTG对照品（批号：051130，葛兰素史克制药有限公司，纯度：99.5%）；苯巴比妥对照品（批号：171222－200504，中国药品生物制品检定所）；内标氯硝西泮（批号：150230-200201，中国药品生物制品检定所）；乙腈、甲醇、二氯甲烷均为进口色谱纯（美国Tedia公司）；磷酸钾缓冲液（PBS，北京中杉金桥生物技术有限公司，分析纯）；异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯）；水为去离子水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：AgilentZorbaxXDB-Cl8柱（150mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：0.1%乙酸-乙腈；梯度程序为：0.00→7.00 min，A∶B=90∶10；7.00→12.00 min，A∶B=70∶30；12.00→14.00 min，A∶B=90∶10。流速：1.0 ml/min；检测波长：240 nm；柱温：40℃；内标：氯硝西泮；结果表明，LTG、PBT和CNZ的保留时间分别约为6.2、10.8和12.7 min，各成分峰形良好，分离完全。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液和内标贮备液的制备
精密称取 LTG、PBT 和 CNZ 10.0、10.0和 5.00 mg，分别置于25 ml量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容配制成400.0，400.0和 200.0 μg/ml的贮备液。
2.3 样本采集
清晨患者服药前抽取静脉血2 ml，室温3500 r/min离心8 min，分离并留取血清，置-20℃冰箱保存，待测。
2.4 血样预处理
冰箱中取出血清，室温解冻，吸取血清200 μl，置5 ml的离心管中，加入CNZ贮备液 10 μl、乙酸乙酯1 ml，涡旋混合60 s，3500 r/min离心10 min，吸取乙酸乙酯，于40℃用氮气吹干，加入甲醇溶液100 μl溶解，精密吸取取20 μl进样。
2.5 线性关系考察
2.5.1 标准血样 精密量取“2.2”项下贮备液适量，用甲醇溶液稀释，加入适量空白人血清，制成含 LTGl.0～50.0 μg/ml、PBT 1.0～150.0 μg/ml的系列浓度标准血样。
2.5.2 线性试验 取 “2.5.1” 项下含 LTG分别为1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/ml，含 PBT 分别为 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、150.0 μg/ml的标准血样，按“2.4”项下方法处理，进样测定，分别以样品与内标的峰面积比Y对浓度C线性回归，得 LTG 标准曲线为：Y=0.1739C-0.0221（r=0.9991）；PBT标准曲线为Y=0.2105C+0.0337（r=0.9990）。表明血清中 LTG 在 1.00～50.00 μg/ml和 PBT 在 1.0～150.0 μg/ml的浓度范围内线性关系良好。
2.6 回收率和精密度实验
取人空白血清200 μl，分别加入LTG和PBT对照品工作液，配成浓度为 2.00、20.00和 40.00 μg/ml和浓度为 5.0、20.0和50.0μg/ml的标准血清。按“2.4”项下方法操作，分别测得两药物的回收率及日内、间精密度，结果见表1。LTG及PBT的平均回收率均＞97.0%，日内精密度＜4.3%，日间精密度＜5.4%。
2.7 干扰实验
在此色谱条件下，苯妥英钠和卡马西平的保留时间分别为15.1 min和21.3 min，对两种药物峰及内标峰均无干扰。用本法监测的56例样品中，亦未见有其他峰干扰。
2.8 人体血样测定
本法用于数例患者服药达稳态后（门诊患者两药均服用1个月后），血清中药物谷浓度（清晨抽取服药前患者空腹血）的测定，患者血清色谱图见图2。
表1 拉莫三嗪、苯巴比妥回收率和日内、日间精密度及回收率Tab.1 Recovery，precisions of intra-day and inter-day of lamotrigine and phenobarbital
3 讨论
3.1 两种药物的结构及药理作用
LTG是一联苯三嗪衍生物，为抗癫痫新药，通过作用于钠离子通道，抑制兴奋型神经递质的释放，从而达到药理活性[7]，近年来已成为血药浓度检测的目标药物。PBT是苯巴比妥（Phenobarbital，PBT）为嘧啶类衍生物，为 GABAA受体激动剂，作用于巴比妥酸位点而增加Cl-的传导[8]。癫痫的治疗一般主张单药治疗，但对于难治性癫痫往往采用联合用药作用于不同靶点而发挥疗效[9]。常用的抗癫痫药物由于其治疗指数小，个体差异大往往需监测合并使用的抗癫痫药的血药浓度。文献[3]有对上述两种药物含量同时测定的报道，但对测量仪器的配制要求较高，一般医疗单位不具备条件。本研究采用梯度洗脱法对化学结构、理化性质差别较大的成分进行较理想分离并对其含量测定。
3.2 波长的选择
文献[3]报道LTG在214 nm波长处吸收最大，可提高LTG测定的灵敏度，但本法采用了240 nm的波长，目的是为了兼顾PBT的含量测定，减少基线的飘移和杂质峰的影响，完全满足临床上检测的需要。
3.3 内标的选择
文献[6]报道LTG的含量测定中采用氟西泮作为内标物，PBT的含量测定[7-9]采用艾司唑仑为内标物。本实验曾尝试用到该两种化合物作内标，但在该色谱条件下与目标峰分离效果不理想，后选用氯硝西泮，考虑到三者具有较理想的分离度，且峰位又不与其他抗癫痫药物及内源性物质重叠，故本研究选择氯硝西泮作为两药物含量同时测定的内标物。
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