姚 建，苏开新，王海华，郭 虎
（株洲市中心医院烧伤整形外科 湖南 株洲 412007）
目前瘢痕疙瘩的发生主要与功能异常的成纤维细胞有关，治疗药物作用机理为抑制或阻断瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、侵袭及胶原形成等生命活动[1-3]。辛伐他汀除降脂作用外，还具有免疫调节和抗器官纤维化的作用[4-5]。辛伐他汀能明显减少兔耳增生性瘢痕的形成[6]，还能抑制人鼻息肉成纤维细胞的增殖和胶原分泌[7]。研究表明，低氧也是瘢痕疙瘩发病的一个重要因素，可通过增加成纤维细胞中促血管形成因子合成、分泌等促进瘢痕疙瘩的发展[8-9]。但未见低氧条件下辛伐他汀对瘢痕成纤维细胞作用的相关报道。本研究探讨低氧条件下辛伐他汀对成纤维细胞增殖、凋亡及瘢痕生成因子表达的影响及相关作用机制，以期为临床应用辛伐他汀防治瘢痕疙瘩生成提供新的理论依据。
1 材料和方法
1.1 试剂和仪器：胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司；Annexin V-FITC、碘化丙啶（PI）购自美国BD公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo Fisher公司；CCK-8试剂、细胞裂解液、上样缓冲液、脱脂奶粉、PVDF膜购自江苏凯基生物技术公司；组织基质金属蛋白酶抑制剂-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP-1)、结缔组织生长因子 (connective tissue growth factor, CTGF)抗体购自美国CST公司；低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、Ⅰ型胶原购自美国Sigma公司；Caspase-3、β-actin、Bax、Bcl-2抗体和二抗购自武汉三鹰生物技术公司 (Proteintech Group,Inc)；ECL显色试剂盒购自上海翊圣生物科技公司。酶标仪(Bio-Tek，美国)，细胞培养箱(Thermo Fisher，美国)，流式细胞仪(BD，US)。
1.2 细胞培养和分组：瘢痕疙瘩标本取自株洲市中心医院整形外科就诊患者，患者术前1周未接受任何药物和手术治疗，患者均知情同意，并经本院医学伦理委员会批准。将瘢痕疙瘩组织去除表皮和皮下组织后，剪成1mm×1mm×1mm的组织块，均匀平铺于75cm2培养瓶中，放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养，每3d更换1次新鲜培养基。1～2周后原代细胞爬出组织块并汇合成片，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取4～6代生长状态良好的细胞进行干预研究。将含2% O2低氧培养箱中培养36h的成纤维细胞设为对照组，对照组基础上添加10μmol/L辛伐他汀处理成纤维细胞设为干预组。辛伐他汀购自中国药品生物制品检定所，用二甲基亚砜配制成浓度为10mmol/L的辛伐他汀母液，过滤除菌后，待用。
1.3 CCK-8法检测细胞增殖情况：将生长状态良好的成纤维细胞以每孔5 000个/100μl接种于2块96孔板，培养24h后去除96孔板中的培养基，各孔加入100μl含辛伐他汀浓度分别为0、0.1、1、10、50、100μmol/L的培养液，每个浓度均设置3个复孔，药物添加后常氧培养箱和2% O2低氧培养箱各放置1块96孔板处理36h，培养结束后加入100μl DMEM、10% CCK-8溶液，37℃孵育2h上机检测450nm波长处的吸光度值，实验重复4次。细胞存活率计算方法：细胞存活率(%)=(干预组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。
1.4 流式细胞术检测细胞凋亡：在低氧条件下用10μmol/L辛伐他汀处理成纤维细胞36h，收集两组细胞，PBS悬浮漂洗2次，每个样品加入5μl Annexin V-FITC按照试剂盒说明书操作进行染色，避光反应0.5h，加入10μl PI后1h内完成流式细胞仪上机检测，实验重复3次。
1.5 Western blotting法检测蛋白表达：在低氧条件下用10μmol/L辛伐他汀处理成纤维细胞36h，收集两组细胞并充分裂解，离心收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，高温水浴使蛋白变性，使用微量进样器上样（上样量为20μl），SDS-PAGE电泳分离，将目标蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉常温封闭，一抗孵育4℃过夜，其中β-actin抗体稀释比例为1:2 000，其它抗体稀释比例为1:1 000，一抗孵育结束后洗膜，孵育二抗，二抗稀释比例为1:5 000，ECL化学发光法显色，定影，拍照，使用Image Pro Plus6.0软件对图片进行灰度扫描半定量分析，实验重复3次。
1.6 统计学分析：统计分析采用SPSS20.0软件，数据以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，检验水准a=0.05。
2 结果
2.1 辛伐他汀在低氧条件下对成纤维细胞增殖的影响：常氧和低氧条件下辛伐他汀作用36h，随着药物浓度的增加成纤维细胞存活率逐渐降低，差异有统计学意义(P＜0.01)；当药物浓度≥10μmol/L时，与常氧组相同浓度比较，低氧组细胞存活率显着减小，差异有统计学意义(P＜0.01)，结果说明低氧条件下辛伐他汀对细胞增殖的抑制作用更强。见表1。
2.2 辛伐他汀在低氧条件下对成纤维细胞凋亡的影响：辛伐他汀作用36h，干预组成纤维细胞凋亡率明显大于对照组，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1。Western blotting结果显示，与对照组比较，干预组细胞促凋亡因子Bax、Caspase-3表达增加，而凋亡抑制因子Bcl-2表达减少，见图2。以上结果说明低氧条件下辛伐他汀可通过上调Bax、Caspase-3表达，下调Bcl-2促进成纤维细胞凋亡。
图1 辛伐他汀在低氧条件下对成纤维细胞凋亡的影响
图2 辛伐他汀对低氧条件下成纤维细胞中凋亡相关蛋白表达的影响
2.3 辛伐他汀在低氧条件下对成纤维细胞中瘢痕生成相关因子的影响：与对照组比较，干预组成纤维细胞中瘢痕生成相关因子HIF-1α、Ⅰ型胶原、CTGF蛋白表达水平显着低于对照组，TIMP-1表达水平则明显高于对照组(P＜0.05)，见图3。
图3 辛伐他汀对低氧条件下成纤维细胞中瘢痕生成相关因子表达的影响
3 讨论
瘢痕疙瘩的发生是多因素共同作用的一个复杂病理过程，而瘢痕成纤维细胞在其中扮演着重要角色。瘢痕疙瘩中的成纤维细胞增殖能力增强，凋亡率较正常皮肤成纤维细胞低，且对诱导凋亡的刺激耐受性增强，胶原合成能力增强，胶原降解能力减弱，并伴随相关细胞因子及受体表达的改变，这些异常改变是导致瘢痕疙瘩发生的重要原因[10-11]。目前治疗瘢痕疙瘩的药物研究也主要集中在抑制细胞增殖，促进凋亡和减少细胞外基质合成，促进胶原降解方面[12]。此外，瘢痕组织中存在因血管闭塞等引起的血供不足及缺氧的微环境，可能是引起创伤过度愈合、皮肤纤维化增生形成瘢痕疙瘩的机制之一[13]。研究发现HIF-1α在病理性瘢痕成纤维细胞中显着升高且促进成纤维细胞的增殖及活力，对瘢痕疙瘩的形成具有一定的促进作用[8]。低氧微环境与瘢痕成纤维细胞异常增殖及胶原合成、细胞外基质重塑紊乱密切相关[14]。寻找低氧条件下能够抵抗瘢痕疙瘩形成的药物，对治疗瘢痕特别是有可能由低氧微环境引起的瘢痕疙瘩具有重要的意义。
表1 低氧和常氧条件下不同浓度辛伐他汀对成纤维细胞存活率的影响 (x¯±s，n=4)
辛伐他汀是一种临床广泛应用的降脂药，减少胆固醇生成，还具有免疫调节及抗炎作用，对心血管疾病、类风湿性疾病及各种器官纤维化疾病都具有保护作用。体外培养的系统性硬皮病成纤维细胞胶原合成增强，相关基因的转录也明显增加，而辛伐他汀能干扰转录因子与I型胶原基因启动子区的结合，从而减少I型胶原基因转录和蛋白合成[15]。本文通过模拟体内低氧病理微环境研究辛伐他汀对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及瘢痕生成因子表达的影响。
结果发现，在低氧条件下，辛伐他汀能够显着抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖，促进细胞凋亡，并抑制HIF-1α、I型胶原和CTGF的合成，且辛伐他汀促进成纤维细胞凋亡与上调Bax、Caspase-3的表达及下调Bcl-2的表达有关。研究表明，辛伐他汀能抑制低氧刺激的细胞增殖，促进低氧下的血管形成[16-17]。低氧条件下，成纤维细胞HIF-1α表达增高，从而启动与血管形成相关因子的基因表达，促进瘢痕生成[9]。辛伐他汀能明显抑制兔耳增生性瘢痕部位CTGF的表达[6]，还可通过抑制CTGF的表达减轻大鼠炎症性肠病肠纤维化进展[18]。这些研究结论为本研究结果提供一定支持。
本次研究还发现，辛伐他汀在低氧条件下能显着增强TIMP-1表达。TIMP-1是基质金属蛋白酶9 (MMP-9)的主要抑制剂，主要调节肿瘤的侵袭生长及血管形成。研究证实MMP-9在瘢痕疙瘩中高表达，促进瘢痕疙瘩向周围浸润生长[19]。TIMP-1表达上调可有效抑制MMP-9表达，从而抑制瘢痕疙瘩的侵袭及血管新生，后续将进一步研究证实。
综上所述，辛伐他汀在低氧条件下可显着抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的体外增殖能力，促进细胞凋亡，Bcl-2、HIF-1α、Ⅰ型胶原及CTGF蛋白表达水平显着降低，Bax、Caspase-3及TIMP-1表达水平明显升高，
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