田玉科 杨少兵
华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科教研室
慢性疼痛是指急性组织损伤修复后疼痛持续状态超过1个月或疼痛反复发作超过3个月以上。长期严重的慢性疼痛会明显影响患者生活质量，给患者带来生理、心理和社会功能的改变。目前的常规治疗方法中没有一种治疗能获得非常满意的疗效， 每种方法都存在一定的缺陷以及各种不良反应。因此寻找一种安全有效、作用持久、经济方便、副作用小的镇痛方法已成为目前研究的焦点。随着细胞分子生物学和基因工程技术的发展，基因治疗作为一项新的生物治疗手段，已被广泛应用于多种疾病的治疗与研究。
疼痛的基因疗法是引入外源基因以超表达内源性止痛物质、抗炎物质或抑制伤害性物质的作用[1-4]而实现的。包括两方面：一是上调抗痛基因的表达，利用基因重组技术将抗痛基因、调控因子基因以及疼痛相关受体基因[5]插入载体，构建重组病毒载体或非病毒载体，导入中枢神经系统内，以初级传入神经和脊髓背角神经作为靶点产生镇痛作用；二是下调疼痛基因表达，通过反义寡核苷酸使目标蛋白水平下调，降低神经系统内源性疼痛分子的表达以达到镇痛目的，或者下调疼痛作用位点，如蛋白激酶C、NMDA受体和神经素1受体等。
1 镇痛基因
1.1 阿片肽基因
目前发现的阿片肽类有二十多种，可分4类：脑啡肽类、β-内啡肽类、强啡肽类及前孤啡肽类。目前用于镇痛研究主要是前两类：
①脑啡肽基因（enkephalin）：包括甲硫氨酸脑啡肽和亮啡肽，是重要的镇痛介质，对δ受体的选择性较强，许多抑制性递质通过脑啡肽介导的阿片受体作用发挥镇痛效应。研究人员将人前脑啡肽原基因插入单纯疱疹病毒（HSV），在小鼠皮下注射脑啡肽原基因重组的病毒后，能逆转百日咳细菌毒素所引起的热痛敏，提示重组有人前脑啡肽原基因的病毒能削弱中枢调节的病理性疼痛和痛觉过敏[6]。此外，携带前脑啡肽原基因的HSV对吗啡耐受的慢性疼痛具有镇痛效果，而利用纳洛酮拮抗可以逆转其镇痛效应[7]，这表明其镇痛作用是通过阿片受体介导的。我们的研究也证实脑啡肽基因是一种良好的镇痛基因：将脑啡肽基因转染入永生化星形胶质细胞，在注射入大鼠蛛网膜下腔后可表达脑啡肽，产生良好的镇痛效果[8]，利用慢病毒作用载体也有同样的镇痛效应[9]。
②β-内啡肽基因（beta-endorphin）：β-内啡肽对μ和δ受体均有较强的亲和力，它的镇痛效应要强于脑啡肽。β-内啡肽能够直接作用于脊髓的μ受体，还能够通过结合脊髓后角中的ε受体，增加脑啡肽的分泌从而产生更强的镇痛效应。研究人员将β-内啡肽基因转入大鼠疼痛模型，测量大鼠的热痛和机械痛，并测定脑脊液内β-内啡肽的浓度，发现β-内啡肽的表达量明显提高，大鼠痛阈也相应增高[10]。
1.2 细胞因子家族
可用于慢性疼痛基因治疗的免疫调节性细胞因子有IL-2和IL-10，具有中枢和外周镇痛作用。Yao等[11]将IL-2基因重组在pcDNA3.1上，构建大鼠疼痛模型后测量其热痛阈，发现采用转IL-2基因能明显发挥镇痛效应，且镇痛效果同IL-2基因表达水平成正相关。
1.3 神经营养因子
神经营养因子是一类能够促进神经细胞分化和再生、刺激神经递质释放及改变神经元特性的蛋白分子，目前用于基因治疗的主要是脑源性神经营养因子（BDNF）。BDNF能在大脑和脊髓水平调节神经肽的功能，从而抑制疼痛信息的传递。Cejas等[12]用永生化神经细胞株转染BDNF基因后，移植到疼痛模型大鼠的蛛网膜下腔，在第2～7周发现能明显降低触诱发痛和热痛过敏。
1.4 疼痛传导路径
痛觉由外周神经进入脊髓背角，在此更换神经元后发出纤维交叉到对侧，经脊髓丘脑侧束上行抵达丘脑，并经过换元进一步投射到大脑皮层，其中的任何一个环节都可能是治疗疼痛的潜在靶点。例如，NR2B是神经元胞膜NMDA受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）的2B亚基，在脊髓水平主要分布于脊髓背角的浅层，参与痛觉信息的传递和调控。我们将NR2B基因插入腺病毒，能在大鼠体内表达NR2B抗原以诱导机体产生NR2B特异性抗体，并与神经元或胶质细胞膜上的NR2B结合，下调NR2B的表达或阻断NR2B的激活，在神经病理性疼痛模型中发挥良好的镇痛作用[13，14]。
2 基因转移载体
载体携带目的基因的高效表达是基因治疗成功的关键。目前将转基因物质导入靶组织的有效方法有多种[2]，可用物理方法如电穿孔、超声、基因枪等，也可用生物或化学载体的方法。载体方法可粗略分为两大类：病毒载体和非病毒载体。
2.1 病毒载体
病毒载体以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白和宿主细胞膜的相互作用，使外源基因进入宿主细胞内。病毒载体转染效率高，转基因表达稳定。这些病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和单纯疱疹病毒。
2.1.1 腺病毒及腺相关病毒腺病毒载体
不同于单链逆转录DNA 病毒载体感染分裂细胞，它在分裂和非分裂细胞中均有高转染效率。有研究证明鞘内注射腺病毒载体后主要感染脑膜细胞，提示腺病毒载体可能有其他特异性的靶细胞[15]。我们的研究采用腺病毒作为载体能够有效表达目的基因，从而产生镇痛效果[13，14]。腺病毒靶细胞的高逆转引起的外源基因瞬时表达是限制其应用的最大障碍。对腺病毒载体进行修饰即为腺相关病毒载体，其本身无害，也不致炎或产生抗体。利用腺相关病毒感染坐骨神经，可以发现在背根神经节上的细、中和粗神经纤维均能有效地表达[16]。相似的研究也证实：携带IL-10基因的腺病毒或腺相关病毒，在注射入蛛网膜下腔后移入脑膜细胞，能逆转脊神经结扎诱发的慢性疼痛症状[17，18]。
2.1.2 单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus， HSV）
HSV为双链DNA病毒，其固有靶细胞是初级传入神经元，这赋予其它载体系统所不能相比的优越性，而其它载体系统没有特异性的靶细胞[19，20]。皮下注射HSV后，直接感染神经元，经过几个周期的复制，进入外周传入神经末梢，逆行至脊髓背根感觉神经节胞体，在胞体中潜伏并不与宿主染色体组发生整合。单纯疱疹病毒载体有如下优点：由其嗜神经性能够作用于专一的靶细胞；经过神经轴突进入中枢，避免了血脑屏障的障碍，给药方式简便，能减少给药次数及减轻药物的副作用。这些优点使HSV在慢性疼痛的基因治疗中颇具前景[21，22]。
2.2 非病毒载体
包括细胞载体、脂质体载体、细菌载体、人工染色体载体及受体载体等。细胞载体包括早期使用的肿瘤细胞，和最近研究较多的神经干细胞、永生化神经细胞，以及骨髓间充质细胞、血管内皮细胞、造血干细胞等其他非神经细胞，具有取材和培养方便、基因转染容易、表达效率高、无移植排斥反应等优点，动物实验中能发挥较好的镇痛效应[8]。脂质体载体已经用于临床，目前用于基因治疗载体的脂质体及其类似物包括阳离子脂质体及其类似物如脂聚-L/D-赖氨酸、聚阳离子脂质体、阴离子脂质体、pH敏感型脂质体、融合脂质体以及在脂质体上连接糖脂或含多羟基物质（如PEG）的立体稳定性脂质体等[23]。目前细菌作为基因治疗载体的实验均是在小鼠体内完成，载体的效力和安全性尚有待进一步研究[24]。
3 慢性疼痛基因治疗的临床研究
目前关于慢性疼痛的基因治疗大都只限于动物实验水平，虽然在动物实验拥有很好的镇痛效果，但是由于动物实验的局限性，使基因镇痛疗法离临床应用依然十分遥远。
目前研究人员已经开始关注基因治疗的临床应用前景。2009年Wolfe的研究小组[25，26]率先将基因治疗疼痛带入临床研究阶段中。他们首先进行了完善的临床前期准备。在构建了HSV介导的前脑啡肽原表达载体和谷氨酸脱羧酶（Glutamic Acid Decarboxylase，GAD）表达载体后，通过动物疼痛模型观察了两种HSV病毒载体的镇痛效果。之后进一步对该病毒载体进行基因修饰，以减少其同源性重组和野生型突变的发生率。两种基因载体经皮下注射小鼠后检测各组织中HSV所携带目的基因的表达水平，结果发现除了注射部位皮肤、邻近肌肉组织以及相应节段的DRG神经元中发现目的基因前脑啡肽原和GAD的表达外，其他组织中没有发现明显的表达，表明该基因载体拥有良好的生物学分布特性。同时还发现小鼠的体重、进食没有变化，各种组织在肉眼及显微镜下均未见明显的病理学改变，小鼠的各项血液生化指标也均正常。这些临床前期研究表明，HSV介导的镇痛基因载体不仅拥有良好的镇痛效果，而且拥有良好的靶向性，在生物学分布以及毒理学上已符合临床研究的要求。这些都是基因治疗疼痛应用于临床人群的基本要求，同时也是一直以来限制基因治疗手段应用于临床的主要因素。Wolfe的研究小组[25，26]在完善的临床前期准备后将这两种HSV基因载体应用于12～24名顽固性癌痛患者，比较不同浓度病毒的镇痛效果，并观察临床副作用。目前该实验结果尚未报道。这是首次将基因治疗慢性疼痛应用于临床人群，其结果值得期待。
4 慢性疼痛基因治疗存在的问题
4.1 慢性疼痛基因治疗的安全性
4.1.1 载体的安全性
非病毒载体一般无毒，而病毒载体都具有一定的神经毒性，特别是HSV。腺病毒的毒性反应主要是通过激发细胞免疫反应造成炎性浸润。同源性重组和野生型突变，以及病毒基因整合入宿主DNA所产生的影响是限制病毒载体应用的一个主要因素。研究表明腺相关病毒能够整合到宿主DNA中，破坏一些重要基因如肿瘤抑制基因、癌基因等，导致肿瘤的产生，从而成为致癌物质[27]。
另外，病毒载体的免疫反应也是其毒性之一。腺相关病毒能够诱导机体产生体液免疫反应，不仅能够在外周血清中检测出抗体，而且在中枢系统中的脑脊液、脑实质等也能发现抗体的存在[28-30]。尤其是当腺相关病毒携带异原性基因时，更容易诱发机体的免疫反应。在动物实验虽然没有发现腺相关病毒诱导的细胞免疫，而在一些临床试验中却发现腺相关病毒能够诱导机体产生细胞免疫反应，并使病毒所携带的目的基因不能表达[31]，但是关于这一方面的临床研究非常有限，缺乏足够的数据支持。
4.1.2 基因产物的安全性
基因产物的有效表达是达到镇痛目的的关键因素，但是其过量表达可能会引起相应的副作用，导致神经功能的损害，如含阿片肽基因载体的过量表达可能会导致呼吸抑制和成瘾性的产生。
当所选择的镇痛靶点不仅仅在疼痛中起重要作用时，其过量表达也会可能引起其他的副作用。如利用蛋白激酶C、NMDA受体、BDNF等基因治疗疼痛时，均存在这种可能性。以NMDA受体为例，NMDA受体是脑内受谷氨酸调控的一类兴奋性氨基酸受体，被激活后可引起钙内流，而钙内流是传递一些细胞内生理病理信号的重要途径。其不仅参与了疼痛病理过程，而且广泛参与机体的多种生理活动，如学习记忆、突触可塑性等，并在其中起着重要的作用[32]。以NMDA受体作为基因治疗的靶点，在达到镇痛目的的同时可能会影响到正常的生理功能，改变神经元的突触可塑性，甚至产生认知功能的损害。我们在利用NMDA基因治疗慢性疼痛时已经注意到这些问题，并对大鼠的认知功能和运动功能进行了相应的观察，其结果令人满意[14，33]。
4.2 基因治疗疼痛的障碍
大多数药物转运受到血脑屏障的障碍。血脑屏障是中枢神经系统与外周之间的生理屏障和代谢屏障，它是一种动态结构，能够根据机体环境快速做出调整以维持中枢神经系统的稳态。研究表明病毒载体、裸寡核苷酸等基因治疗手段均不能有效进入中枢神经系统。解决这一问题的方法有：①直接从实质内或蛛网膜下注射复合物；②绕开血脑屏障转运进入中枢；③一过性地破坏血脑屏障，使注射的复合物能透过。第一种方法虽然能够取得最为直接的镇痛效果，但其注射方式所带来的创伤也不容忽视。HSV是第二种方法的典型代表，利用HSV作为载体能够经过外周内源性轴浆转运系统绕开血脑屏障，进入中枢神经系统，这似乎是疼痛基因治疗的理想方法。第三种方法也许会拓宽我们的治疗手段，例如疼痛对血脑屏障通透性的影响，使得外周用药进入中枢系统成为可能。因为包括疼痛在内的一些病理状态会影响血脑屏障的结构和功能，使其通透性发生相应的调整。而且，疼痛引起的炎性反应也能破坏内皮细胞间的紧密连接和粘着连接，形成内皮裂缝，导致血脑屏障的完整性遭到破坏，通透性增加[34]。这为外周给药到中枢神经系统提供了良好的途径。
随着生物治疗技术的发展，有望发现并筛选出更为合适的基因载体，能够更有效地表达目的基因；同时对慢性疼痛机制的深入研究，会发现更为明确的疼痛干扰基因，将两者有效结合有望能为慢性疼痛患者带来满意的治疗效果。而且，在对基因治疗安全性的不断追求与验证中，基因治疗这一新颖的治疗方法不仅能够提供足够的镇痛效果，还能为慢性疼痛患者排除其他治疗手段所带来的副作用。
[1]Meunier A., Braz J, Cesselin F, et al. From inflammation to pain:experimental gene therapy[J]. Med Sci (Paris), 2004, 20(3): 325-30.
[2]Pohl M, Braz J. Gene therapy of pain: emerging strategies and future directions[J]. Eur J Pharmacol., 2001, 429(1-3): 39-48.
[3]Pohl M, Meunier A, Hamon M, et al. Gene therapy of chronic pain [J]. Curr Gene Ther., 2003, 3(3): 223-38.
[4]Glorioso JC, Mata M, Fink DJ. Gene therapy for chronic pain [J]. Curr Opin Mol Ther., 2003, 5(5): 483-8.
[5]Xu Y, Gu Y, Xu GY, et al. Adeno-associated viral transer of opioid receptor gene to primary sensory neurons: a strategy to increase opioid antinociception [J]. Proc Natl Acad Sci USA., 2003, 100: 6204-9.
[6]Yeomans DC ,Jones T ,Laurito CE, et al. Reversal of ongoing thermal hyperalgesia in mice by a recombinant herpesvirus that encodes human preproenkephalin[J]. Mol Ther., 2004, 9 (1) : 24-9.
[7]Yoshimura N, Franks ME, Sasaki K, et al. Gene therapy of bladder pain with herpes simplex virus (HSV) vectors expressing preproenkephalin(PPE) [J]. Urology, 2001, 57:116.
[8]Xu Y, Tian XB, An K, et al. Lumbar transplantation of immortalized enkephalin-expressing astrocytes attenuates chronic neuropathic pain[J].Eur J Pain., 2008, 12(4): 525-33.
[9]Tian X, Wang G, Xu Y, et al. An improved tet-on system for gene expression in neurons delivered by a single lentiviral vector [J]. Hum Gene Ther., 2009, 20(2): 113-23.
[10]Wu CM, Lin MW, Cheng JT, et al. Regulated ,electroporation-mediated delivery of pro- opiomelanocortin gene suppresses chronic constriction injury-induced neuropathic pain in rats[J ]. Gene Ther., 2004, 11(11): 933-40.
[11]Yao MZ, Gu JF, Wang JH, et al. Adenovirus-mediated interleukin-2 gene therapy of nociception [J]. Gene Ther., 2003, 10 (16) :1392-9.
[12]Cejas PJ ,Martinez M ,Karmally S, et al. Lumbar transplant of neurons genetically modified to secrete brain - derived neurotrophic factor attenuates allodynia and hyperalgesia after sciatic nerve constriction [J].Pain, 2000, 86 (1-2): 195-210.
[13]Wang GM, Tian YK, Chen JP, et al. Evaluation of NR2B peptide as subunit vaccines against experimental neuropathic pain [J]. Chin Med J (Engl).,2007, 120(8): 643-7.
[14]Wang GM, Tian XB, Chen JP, et al. Prevention of neuropathic pain in an animal model of spare nerve injury following oral immunization with recombinant adenovirus serotype 5-mediated NR2B gene transfer [J].Gene Ther., 2007, 14(24): 1681-7.
[15]Gudmundsson G, Bosch A, Davidson BL, et al. Interleukin-10 modulates the severity of hypersensitivity pneumonitis in mice [J]. Am J Respir Cell Mol Biol., 1998, 19(5): 812-8.
[16]Gu Y, Xu Y, Li GW, et al. Remote nerve injection of mu opioid receptor adeno-associated viral vector increases antinociception of intrathecal morphine[J]. J Pain.,2005, 6(5): 447-54.
[17]Milligan ED, Sloane EM, Langer SJ, et al. Controlling neuropathic pain by adeno-associated virus driven production of the anti-in fl ammatory cytokine,interleukin-10[J]. Mol Pain., 2005, 1:9.
[18]Milligan ED, Langer SJ, Sloane EM, et al. Controlling pathological pain by adenovirally driven spinal production of the anti-in fl ammatory cytokine,interleukin-10[J]. Eur J Neurosci., 2005a, 21(8): 2136-48.
[19]Mata M, Hao S, Fink DJ. Gene therapy directed at the neuroimmune component of chronic pain with particular attention to the role of TNF-α[J].Neurosci Lett., 2008, 437(3): 209-13.
[20]Mata M, Glorioso J, Fink DJ. Development of HSV-mediated gene transfer for the treatment of chronic pain [J]. Exp Neurol., 2003, 184(Suppl 1):S25-9.
[21]Zhou Z, Peng X, Hao S, et al. HSV-mediated transfer of interleukin-10 reduces inflammatory pain through modulation of membrane tumor necrosis factor alpha in spinal cord microglia [J]. Gene Ther., 2008, 15(3):183-90.
[22]Hao S, Mata M, Glorioso JC, et al. HSV-mediated expression of interleukin-4 in dorsal root ganglion neurons reduces neuropathic pain[J].Mol Pain., 2006, 2:6.
[23]Ramesh R ,Saeki T ,Templeton NS, et al. Successful treatment of primary and disseminated human lung cancers by systemic delivery of tumor suppressor genes using an improved liposome vector[J]. Mol Ther., 2001,3(3): 337-50.
[24]Mei S, Theys J, Landuyt W, et al. Optimization of tumor-targeted gene delivery by engineered attenuated Salmonella typhimurium[J]. Anticancer Res., 2002, 22 (6A): 3261-6.
[25]Wolfe D, Wechuck J, Krisky D, et al. A Clinical Trial of Gene Therapy for Chronic Pain [J]. Pain Med., 2009, 10(7): 1325-30.
[26]Wolfe D, Mata M, Fink DJ. A human trial of HSV mediated gene transfer for the treatment of chronic pain [J]. Gene Therapy, 2009,16(4): 455-60.
[27]Smith RH. Adeno-associated virus integration: virus versus vector [J].Gene Therapy, 2008, 15: 817–22.
[28]Kaplitt MG, Feigin A, Tang C, et al. Safety and tolerability of gene therapy with an adenoassociated virus (AAV) borne GAD gene for Parkinson’s disease: an open label, phase I trial[J]. Lancet, 2007, 369: 2097-105.
[29]Marks Jr WJ, Ostrem JL, Verhagen L, et al. Safety and tolerability of intraputaminal delivery of CERE-120 (adeno-associated virus serotype 2-neurturin) to patients with idiopathic Parkinson’s disease: an openlabel, phase I trial[J]. Lancet Neurol, 2008, 7:400-8.
[30]Worgall S, Sondhi D, Hackett NR, et al. Treatment of late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis by CNS administration of a serotype 2 adenoassociated virus expressing CLN2 cDNA[J]. Hum Gene Ther., 2008,19: 463-74.
[31]Herzog RW. Immune responses to AAV capsid: are mice not humans after all[J]? Mol Ther., 2007, 15: 649-50.
[32]Kalia LV, Kalia SK, Salter MW. NMDA receptors in clinical neurology:excitatory times ahead[J]. Lancet Neurol., 2008, 7(8):742-55.
[33]杨少兵, 王公明, 田玉科, 等. rAd5/NR2B镇痛疫苗对神经病理性痛大鼠认知功能的影响[J]. 中华麻醉学杂志, 2010, 30(2): 162-4.
[34]Lalive PH. Autoantibodies in in fl ammatory demyelinating diseases of the central nervous system[J]. Swiss Med Wkly., 2008, 138(47-48): 692-707.
傅志俭，女，主任医师，山东大学教授、博士生导师，现任山东省立医院麻醉科主任兼疼痛科主任。
为国际疼痛研究会（IASP）会员、中国医师协会麻醉学医师分会副主任委员、中华医学会疼痛学分会常务委员、山东省医师协会麻醉学医师分会主任委员、山东省医学会疼痛学分会主任委员、山东省中西医结合学会麻醉与镇痛专业委员会副主任委员、《中华麻醉学杂志》通讯编委、《国际麻醉学与复苏杂志》、《中国疼痛医学杂志》、《临床麻醉学杂志》、《实用疼痛学杂志》、《山东医药》、Anaesthesia（中文版）编委。
电子邮箱：zhijian_fu@163.com
田玉科，主任医师、教授、博士生导师、博士后指导教师。
现任华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室主任。中华医学会理事、中华医学会麻醉学分会副主任委员、中德医学协会副理事长、中国医师协会麻醉学医师分会常委、湖北省医学会常务理事、中华医学会武汉分会副会长、武汉市科协委员、德国麻醉与危重医学协会“荣誉会士”、美国麻醉医师协会会员；《中华麻醉学杂志》、《临床麻醉学杂志》常务编委，《华中科技大学学报（英德文版）》，《临床外科学杂志》编委。1992年起享受国务院特殊津贴。
从事临床麻醉及危重医学三十余年，主要研究方向为疼痛基础与治疗，麻醉与免疫，血液稀释在围术期的应用。近年来在国际国内专业杂志上发表论文二百余篇，SCI收录8篇，其主要研究成果发表在Gene Therapy、Huamn Gene Therapy、European Journal of Pain、Brain Research等杂志。主编着作4部，副主编着作2部，参编教材及着作十余部。先后以课题负责人承担国家自然科学基金4项，国家教育部归国人员基金1项，国家教育部博士点基金1项，湖北省科技厅重点攻关项目2项，湖北省卫生厅科研基金1项，国际合作课题2项。
2006年获湖北省科技进步二等奖1项，2001年获湖北省科技进步三等奖1项，1999年湖北省卫生厅科技进步二等奖1项，2005年、2006年连续两年获武汉市科技进步三等奖1项。
电子邮箱：yktian@tjh.tjmu.edu.cn
