邱丽，么楠，苗温，邹伟，蔡晓红



1例B（A）02等位基因的鉴定及分子机制研究

邱丽1，么楠1，苗温1，邹伟2，蔡晓红2

目的B（A）02等位基因的鉴定及分子机制的研究。方法对1例B（A）02等位基因者ABO血清学定型使用标准血清学实验方法，对ABO基因7个外显子及其侧翼序列做PCR扩增、基因克隆和测序分析；使用PyMOL软件建立B糖基转移酶（GTB）的空间模型并进行分析。结果血清学检测结果符合B（A）亚型特点，DNA克隆和测序分析显示被检者为B（A）02/O01杂交基因，在B101等位基因上存在700C＞G错义突变，导致GTB发生P234A氨基酸置换。通过对GTB空间结构的分析，认为P234A置换影响了第234位氨基酸与Met-266的分子间作用力，从而改变了GTB识别供糖体的结合凹槽的结构，使GTB能够结合并转移N-乙酰氨基半乳糖（GalNac）至底物H抗原，从而在红细胞膜上形成弱A抗原。结论P234A的置换影响了决定GTB识别特异性的Met-266与Ala-268所组成的特异性识别区域的空间结构，从而改变了ABO血型的抗原性。

ABO血型系统；等位基因；B（A）亚型；PyMOL软件

B（A）亚型是一种独特的ABO变异型，表现为同一等位基因的编码产物兼具A和B特异性的糖基转移酶活性，其ABO血型表观遗传学不符合孟德尔规律，以顺式遗传为特点［1-2］。关于B（A）亚型的基因背景有两种不同的假说［1］：（1）显着增强的B转移酶活性能够催化N-乙酰氨基半乳糖（GalNac）从UDP-N-乙酰氨基半乳糖（UDP-GalNac）到2′-岩藻糖，形成一种具有A活性的结构。（2）编码糖基转移酶的基因（即ABO基因）发生错义突变。目前研究发现后者更多见［3］。至2015年5月为止，人类血型基因突变库（BGMUT）已报道的B（A）等位基因有6种［4］。1993年Yamamoto等［5］首次报道1种能够编码正常B糖基转移酶（glycosyltransferases B，GTB）的ABO等位基因同时具有A糖基转移酶（glycosyl-transferases A，GTA）活性，这个等位基因被命名为B（A）01。B（A）02、B（A）04、B（A）05和B（A）06均首先在中国人群中发现，且以B（A）04和B（A）02的基因频率为最高（1.6/10万和0.78/10万）［2］。本文旨在分析B（A）02等位基因，并初步探讨其分子机制。

1对象与方法

1.1研究对象1例B（A）表现型的无偿献血者，男，25岁，汉族，于2014年在天津市滨海新区塘沽中心血站献血时被检出正反定型不符。使用EDTA-K2抗凝管采集5 mL献血者外周静脉血液进行血清学和分子生物学检测。

1.2试剂与仪器单克隆抗-A、抗-B（批号20131224）、抗-H血清（批号20130408）、抗-A1血清（批号20140923）和ABO反定型红细胞（批号20145345）均为上海血液生物医药有限公司生产。抗-AB（DIAGAST，批号439000）；A2细胞（批号115247C，Immucor公司），人源抗-A（自制试剂，效价128），基因组DNA抽提试剂盒（批号M1218，天根生物产品），DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒（批号M00529，GeneMark产品）；pMD18-T载体（批号K6601B，日本TaKaRa公司产品）。细胞洗涤离心机（KA-2200型，日本久保田），测序仪（ABI377，美国Applied Biosystems公司）。

1.3血型血清学检测采用盐水试管法进行ABO血型鉴定和吸收放散试验。吸收放散试验：取1 mL献血者压积红细胞和1 mL正常O型压积红细胞作为对照，两者中分别加入等体积的人源抗-A血清，混匀后放置4℃冰箱中吸收1 h，然后于56℃水浴中热放散，两者的放散液再分别与A1试剂红细胞反应［6］。

1.4 DNA提取和PCR扩增反应使用基因组DNA抽提试剂盒抽提外周血基因组DNA。PCR使用的引物根据ABO基因序列（GenBank Accession Number N_000009）参照文献［7］。引物设计，按如下条件扩增1～7外显子：95℃3 min，95℃30 s、56℃30 s、72℃60 s，30个循环，最后72℃延伸8 min。

1.5 PCR产物直接测序采用DNA琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化PCR产物，并使用测序仪对ABO基因7个外显子及其侧翼序列直接测序分析。

1.6 PCR产物的克隆及测序将第7外显子的PCR产物纯化后克隆入pMD18-T载体，随后应用测序仪分析PCR插入片段DNA序列。PyMOL软件（DeLano Scientific LLC，v0.99）建立GTB三维模型。

2　结果

2.1血型血清学检测

2.1.1 ABO血型鉴定试管法中，献血者红细胞与单克隆抗-A试剂反应呈弱阳性（2+），与单克隆抗-B和单克隆抗-H试剂反应均呈强阳性（4+），同时将正常O细胞、B细胞与抗-H反应作为对照，结果分别为强阳性（4+）、弱阳性（2+）；献血者血清与A1试剂红细胞反应呈弱阳性（2+），与A2试剂红细胞反应呈弱阳性（1+），与试剂B细胞和O细胞均不反应。血清学表现符合B（A）亚型特点。

2.1.2吸收放散试验献血者红细胞放散液与A1试剂红细胞反应结果为强阳性（3+），O型对照红细胞放散液与A1试剂红细胞反应结果为阴性，证实献血者红细胞上存在弱A抗原。

2.2 DNA测序献血者的ABO基因型为B（A）02/ O01，B等位基因第7外显子存在700C＞G错义突变，导致GTB的P234A氨基酸置换，见图1。

箭头a所示为第7外显子700C＞G杂合突变；箭头b所示为703G＞A杂合突变Fig. 1 Partial sequence analysis of ABO gene sequencing图1　ABO基因序列检测的部分序列检测图谱

2.3对GTB的空间模型的分析P234与Met-266在空间结构上十分靠近，P234A置换使脯氨酸吡咯环C-γ原子处发生中空，影响其与Met-266间原有的分子间作用力，从而影响Met-266的侧链方向，造成酶活性中心Met-266和Ala-268组成的“结合凹槽”的大小的改变，使GTB可以结合部分N-乙酰氨基半乳糖（GalNac），见图2～5。

Fig. 2 Relationship between three dimensional structure of GTB and spatial position of four key amino acids（Gly-176，Ser-235，Met-266，Ala-268）and Pro-234 in GTB图2　GTB三维结构图（PDB ID：2RJ8）及4个关键氨基酸（Gly-176、Ser-235、Met-266、Ala-268）和Pro-234的空间位置关系

Fig. 3 Relationship between spatial position of Pro-234 and Met-266 side chain before mutation图3　突变前Pro-234与Met-266侧链的空间位置关系

Fig. 4 Relationship between spatial position of ALA-234 and Met-266 side chain after mutation图4　突变后ALA-234与Met-266侧链的空间位置关系

Fig. 5 The sketch diagram of the disappearance of C-γ after mutation图5　突变后C-γ原子缺失示意图

3　讨论

人类血型A、B抗原是由糖基转移酶催化寡糖不断连接合成的碳水化合物结构，而特异性的糖基转移酶是由ABO基因指导合成。A基因和B基因cDNA序列存在7个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），分别是297A＞G，526C＞G，657C＞T，703G＞A，796C＞A，803G＞C和930G＞A，其中4个SNPs为错义突变，造成Arg176Gly、Gly235Ser、Leu266Met、Gly268Ala这4个关键氨基酸置换［8］。01等位基因由于发生261delG移码突变，编码截短的无功能酶。人类ABO血型GTA和GTB具有高度同源性，354个氨基酸中仅4个关键氨基酸的不同却造成了ABO抗原合成、酶动力学和结构的显着区别。由于4个关键氨基酸中仅266R和268R占据了GTA和GTB活性反应区中能与核苷糖结合的位置，且两者的侧链和UDP-Gal/GalNac之间存在高度互补的空间立体化学关系［9］，因此第266R和268R在酶对供糖体特异性识别和结合过程中起决定作用［10-11］。而酶动力学和晶体学研究证明，266R 比268R更为关键，因为只有266R是与核苷糖中显有供糖体特异性的基团（Gal的羟基和GalNac的乙酰氨基）结合并反应，从而使GTA、GTB区别供糖体的特异性而形成A、B抗原，268R则是与两种核苷糖共有的相同基团结合［11-12］。

本研究中的献血者因ABO正反定型不一致，进一步检测发现其红细胞定型为AweakB特点，且与抗-H反应强度接近O细胞，血清中存在抗-A抗体，血清学表型符合B（A）亚型的特点。测序表明其基因型为B（A）02/O01，其B基因在B101的基础上发生700C＞G突变，导致第234位脯氨酸置换为丙氨酸，该突变使B基因带有了A基因的特点。对于B（A）02等位基因导致B（A）表型分子机制的深入研究，国内文献少见报道，仅有文献推测是由于第234位氨基酸与Ser-235紧密相连，空间结构非常靠近，从而造成了影响［13-14］，但论据缺乏。而国外研究认为，Ser-235的作用是影响酶-供糖体复合物与底物H抗原的识别和结合，对酶识别供糖体的特异性并无影响［11，15-17］。因此本文通过使用PyMOL软件建立GTB空间模型，对700C＞G突变导致的P234A置换进行分析。从图2可以看出第1个关键氨基酸Gly-176距离酶活性中心较远；Met-266和Ala-268为一对面对面的氨基酸，两者共同形成一“瓶颈”，控制与之结合的供糖体大小及结构［18］；Ser-235则出现在与底物结合较近的区域。围绕P234的氨基酸有Met-266、Ser-235、His-233。野生型GTB中第234位脯氨酸属于杂环氨基酸，图3显示脯氨酸中的吡咯环在空间构象上与Met-266的长侧链非常靠近，GTB发生P234A置换后，丙氨酸的空间结构使原有的脯氨酸吡咯环位置的C-γ原子发生缺失。而脯氨酸吡咯环的C-γ原子与Met-266的侧链通过范德华力连接，C-γ原子的改变会影响Met-266侧链的方向［19］。因此P234A置换后，丙氨酸失去了该位置原有的C-γ原子，进而失去其与Met-266侧链之间的范德华力，使Met-266的侧链发生方向改变，导致Met-266和Ala-268形成的结合凹槽的空间结构发生改变，可以容纳下UDP-GalNac，最终使突变的GTB能够转移一部分UDP-GalNac到底物H抗原，从而在红细胞表面形成弱A抗原。此即本文提出的B（A）02等位基因导致B（A）表形的分子机制。

此外，P234在空间位置上除了和Met-266接近外，与Ser-235和His-233也十分接近。Ser-235和His-233主要影响酶-供糖体复合物与底物H抗原的结合。本例献血者红细胞与抗B试剂反应呈强凝集，并未减弱，说明GTB-UDPGal与H抗原的结合正常，因此推测P234A置换没有影响Ser-235和His-233。本文没有能够进行酶动力学试验，进一步考察GTB催化转移Gal的效率，是为不足之处。

目前BGMUT数据库已报道的B（A）02等位基因对应的氨基酸置换有5种：R176G、P234A、G235S、L266M和G268A。可以看出，除了P234A，其余4种置换均发生在4个关键氨基酸处，由此可见，由于P234在空间构象上距离影响酶识别供糖体特异性的Met-266非常近，因此P234的改变会造成两者之间分子间作用力的改变，从而影响GTB对供糖体底物的识别和结合，形成B（A）亚型的红细胞血型。

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（2015-09-22收稿2015-12-20修回）

（本文编辑魏杰）

Identification and molecular mechanism study of a case with B（A）02 allele

QIU Li1，YAO Nan1，MIAO Wen1，ZOU Wei2，CAI Xiaohong2
1 Binhai Tanggu Blood Station，Tianjin 300456，China；2 Rui Jin Hospital Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Corresponding Author E-mail：cxh8407@126.com

Objective To identify and investigate B（A）02 allele in a patient. Methods Serological tests were performed with standard serological methods in a patient with B（A）02 allele. DNA sequences of all seven exons and exon -intron boundaries of ABO gene were analyzed by polymerase chain reaction（PCR），direct DNA sequencing and sequencing after gene cloning. In order to analyze the allele，PyMOL software was used to establish 3D model of Glycosyltransferases B （GTB）. Results The serological results showed the characteristics of B（A）phenotype. DNA analysis revealed that ABO gene of the individual was heterozygous of B（A）02/O01 allele. 700C＞G mutation was identified in B101 allele，which resulted in the amino acid substitution P234A in GTB. Through the analysis of the 3D structure of GTB，it was speculated that the P234A replacement affected the intermolecular forces of the 234 amino acid and Met- 266，thus changed the conformation of the donor-binding pocket of GTB，that made GTB capable of recognizing and tranferring the GalNac to the H antigen，which can lead to the formation of the weak A antigen on membrane of red blood cells. Conclusion The P234A replacement can affect the spatial conformation of the specific recognition region conformed by Met- 266 and Ala-268 residues，which leads to the antigenicity change of the ABO blood group.

ABO blood-group system；alleles；B（A）subgroup；PyMOL software

R457.1+1

A

10.11958/20150187

1天津市滨海新区塘沽中心血站检验科（邮编300456）；2上海交通大学医学院附属瑞金医院临床输血科

邱丽（1982），女，主管技师，学士，主要从事免疫血液学方面研究

E-mail：cxh8407@126.com