右旋-色氨酸对变异链球菌生物膜形成及离散的影响

杨晓月，廖晓辉，叶静，邵灿，王斌，刘颖△

右旋-色氨酸对变异链球菌生物膜形成及离散的影响

杨晓月1，廖晓辉2，叶静3，邵灿1，王斌1，刘颖1△

目的探讨右旋-色氨酸（D-Trp）对变异链球菌（S.mutans）生物膜形成及离散的影响，以及在D-Trp作用下S.mutans对氯己定（CHX）药物敏感性的变化。方法吸光度法检测5.0 mmol/L D-Trp对悬浮S.mutans生长的影响，非处理组不作D-Trp处理；结晶紫染色法检测1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp处理组S.mutans生物膜形成的变化，非处理组不添加D-Trp；结晶紫染色法及激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp处理组对24 h S.mutans生物膜的离散作用；刃天青钠盐指示法检测5.0 mmol/L D-Trp处理（实验组）和阴性对照组的最小抑菌浓度（MIC）及最小生物膜抑菌浓度（MBIC）。结果单菌种悬浮S.mutans在D-Trp处理组与非处理组的作用下，28 h内生长趋势一致，均从4 h开始进入对数期，22 h到达平台期。1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp处理组与非处理组相比，S.mutans生物膜在0～72 h内生物膜生物量均随时间推移而增加；同一时间点，各处理组各时点生物膜生物量均低于非处理组（P＜0.05）。结晶紫染色法示1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp处理组生物膜生物量（OD570）均低于非处理组（P＜0.01）。激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示，1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp处理组均有细菌黏附于介质表面，处理组生物膜生物量低于非处理组（P＜0.01）。实验组和阴性对照组对S.mutans的MIC均为0.073 mg/L，对S.mutans的MBIC分别为0.293 mg/L和2.344 mg/L，添加5.0 mmol/L D-Trp后，CHX对S.mutans的MBIC降至1/8。结论D-Trp能够抑制生物膜形成，促进已形成生物膜离散，并提高S.mutans对CHX的敏感性。

链球菌，变异；生物膜；氯己定；微生物敏感性试验；右旋色氨酸；最小抑菌浓度

变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）作为龋病最主要的致病菌，可黏附于牙面形成牙菌斑生物膜，从而在适当条件下产生大量的酸性物质而致龋［1］。生物膜因其特殊的结构及理化性质，使其中的细菌对抗菌药的敏感性远远低于浮游状态的细菌［2］。近期研究发现，成熟的枯草芽孢杆菌生物膜通过产生多种右旋氨基酸（D-amino acids，D-AA）来抑制自身生物膜形成，促进已成熟的生物膜离散［3］。另有研究显示，D-AA混合物能够增强S.mutans对乳酸链菌素的敏感性［4］。本实验通过研究右旋-色氨酸（D-Tryptophan，D-Trp）对S.mutans生物膜形成及离散的作用，以期寻找有效控制菌斑生物膜的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料S.mutans UA159菌株（天津医科大学口腔医学院实验室）。脑心浸出液培养基（BHI，奥博星生物技术有限责任公司）、D-AA（美国Sigma公司）、SYTO-9/PI混合染料（美国Invitrogen公司）、激光共聚焦培养皿（无锡耐思生物科技有限公司）、葡萄糖酸氯己定溶液（上海拜力生物科技有限公司）、刃天青钠盐（上海麦恪林生化科技有限公司）。722型可见光分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、SynergyMx多功能酶标计（美国BioTek公司）、激光扫描共聚焦显微镜（FV1200，日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 D-Trp对悬浮S.mutans生长的影响将S.mutans培养至对数生长期，菌悬液以体积比1∶50（下同）稀释于BHI液体培养基中，处理组添加5.0 mmol/L D-Trp，非处理组不添加D-Trp，静置培养28 h。每隔2 h用紫外分光光度计测菌悬液在600 nm处的光密度（OD600）值，绘制单菌种悬浮S.mutans的生长曲线。

1.2.2 结晶紫染色法检测D-Trp对S.mutans生物膜形成的影响参照文献［5］，将S.mutans培养至对数生长期，接种于96孔板，处理组分为3个亚组，分别加入含1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp的BHI培养液。非处理组不添加D-Trp，每组3个复孔，静置培养。培养4、12、24、48及72 h时，取各组培养液，去除培养基及悬浮细菌，PBS冲洗，每孔加200 μL结晶紫溶液，染色15 min，ddH2O漂洗，37℃温箱烘干10 min，每孔加200 μL体积分数33%的醋酸，待其完全溶解，酶标仪检测菌悬液在570 nm处的OD570。

1.2.3 结晶紫染色法检测D-Trp对24 h S.mutans生物膜的离散作用以96孔板为介质建立S.mutans 24 h单菌种生物膜，静置培养24 h，去除原培养液及悬浮细菌。处理组分别加入含1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp的BHI培养液，非处理组不添加D-Trp，每组3个复孔，继续培养24 h。结晶紫染色法检测各组S.mutans生物膜总生物量（OD570）［5］。

1.2.4 激光扫描共聚焦显微镜观察D-Trp对24 h S.mutans生物膜的离散作用以激光共聚焦培养皿为介质建立S.mutans单菌种生物膜，每皿加入2 mL稀释菌液，封口膜封闭培养皿接口，静置培养24 h。去除原培养液及悬浮细菌，处理组分别加入含1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp的BHI培养液，非处理组不添加D-Trp，继续培养24 h。无菌生理盐水轻洗皿底2次，去除悬浮菌，避光条件下，每皿加入1 mL混合染液SYTO-9/PI，室温避光静置染色15 min。无菌生理盐水冲洗去除多余染料，吸尽冲洗液，无菌生理盐水封片，待观察。每组随机读取3个视野，以激光扫描共聚焦显微镜分层扫描生物膜样本，Imaris软件对图像进行三维重建并测量生物膜绿色荧光体积、生物膜红色荧光体积，并以红色荧光和绿色荧光体积的总和作为细菌生物膜的总生物量。

1.2.5 D-Trp与氯己定（chlorhexidine，CHX）联合应用对悬浮S.mutans最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）的影响将S.mutans培养至对数生长期，接种于96孔板，实验组加入100 μL含5.0 mmol/L D-Trp的BHI培养基，阴性对照组培养基中不添加D-Trp，空白对照组不接种S.mutans，仅加入等量的BHI。每组3个复孔，每孔加入含质量分数为0.001%刃天青钠盐［6］的BHI培养基30 μL。质量分数为0.12%的CHX按照二倍稀释法后，依次加入各组，静置培养24 h。参照文献［7］确定MIC。空白对照组未接种S.mutans，不同浓度的CHX对其无影响，用于计算实验组和阴性对照组的MIC。

1.2.6 D-Trp与CHX联合应用对S.mutans生物膜MIC（MBIC）的影响以96孔板为介质建立24 h S.mutans单菌种生物膜，PBS冲洗。实验组加入100 μL 5.0 mmol/L D-Trp的BHI培养基，阴性对照组培养基中不添加D-Trp，空白对照组不接种S.mutans，仅加入等量的BHI。每组3个复孔，静置培养24 h；质量分数为0.12%的CHX按照二倍稀释法逐级稀释，依次加入各组，静置培养24 h；每孔加入含0.001%的刃天青钠盐的BHI培养基30 μL，继续培养24 h，参照文献［7］确定MBIC。

1.3 统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D-Trp对悬浮S.mutans生长的影响单菌种悬浮S.mutans在D-Trp处理组与非处理组的作用下，28 h内生长趋势一致，均从4 h开始进入对数期，22 h到达平台期，见图1。

Fig.1Growth curves of D-Trp on planktonic S.mutans图1 悬浮S.mutans的生长曲线

2.2 D-Trp对S.mutans生物膜形成的影响1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp处理组与非处理组相比，S.mutans生物膜在0～72 h内生物膜生物量均随时间推移而增加；同一时间点，各处理亚组各时点生物膜生物量均低于非处理组（P＜0.05），见图2。

Fig.2Effects of different concentrations of D-Trp on the formation of S.mutans biofilms图2 不同浓度D-Trp对S.mutans生物膜形成的影响

2.3 D-Trp对S.mutans生物膜的离散作用结晶紫染色法示1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp处理组生物膜生物量（OD570）均低于非处理组（0.132±0.008、0.087±0.004、0.071±0.002及0.298±0.006，F= 691.326，P＜0.01）。激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示，1.0、2.5及5.0 mmol/L D-Trp处理组均有细菌黏附于介质表面，其生物膜生物量分别为（5 964.667±197.356）μm3、（6 091.000±418.442）μm3及（2 736.333±91.040）μm3，明显低于对非处理组（114 150±1 208.445）μm3，差异有统计学意义（F=14 189.949，P＜0.01），见图3。

2.4 D-Trp与CHX联合应用对悬浮S.mutans MIC的影响实验组和阴性对照组对S.mutans的MIC均为0.073 mg/L。

2.5 D-Trp与CHX联合应用对S.mutans MBIC的影响实验组和阴性对照组对S.mutans的MBIC分别为0.293 mg/L、2.344 mg/L，添加5.0 mmol/L DTrp后，CHX对S.mutans的MBIC降至阴性对照组的1/8。

3 讨论

细菌生物膜在许多疾病的发生中起到重要作用。如S.mutans作为龋病的主要致病菌，通过黏附于牙齿或修复体表面，从而在口腔中定植并形成生物膜，并产生毒性作用［1，8］。生物膜集落固有的保护性质使得绝大多数生物膜相关感染难以甚至不可能根除［9］。有研究证实，破坏生物膜有利于其相关疾病，如糖尿病足［10］、根尖周炎［11］、牙周病［12］等的预防与控制。

Kolodkin-Gal等［3］研究发现，成熟的枯草芽孢杆菌生物膜在成熟后期通过自发产生D-AA来促进生物膜离散，实现细菌的播散。然后，D-AA对生物膜的作用开始被关注。目前，已有研究证实，外源性添加D-AA对枯草芽孢杆菌［3］、铜绿假单胞菌［13］、金黄色葡萄球菌［14］、牙龈卟啉单胞菌［15］、变异链球菌［16］等致病生物膜亦具有一定的破坏作用；而D-Trp能抑制铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌生物膜的形成［17-18］，且能够离散枯草芽孢杆菌已形成的生物膜［3］。

本研究发现，添加或不添加D-Trp，悬浮S.mutans生长趋势一致，且5.0 mmol/L D-Trp与CHX联合应用和单独应用CHX对S.mutans的MIC均为0.073 mg/L，证实了D-Trp对悬浮S.mutans生长无抑制作用。结晶紫染色及激光扫描共聚焦电镜结果显示，1.0、2.5、5.0 mmol/L D-Trp均能抑制S.mutans生物膜的形成，离散已形成生物膜，其中以5.0 mmol/L的浓度作用最为显着。

既往研究证实，D-AA在离散生物膜的同时，有助于提高细菌对抗菌药物的敏感性；D-酪氨酸与阿米卡星联合应用使得铜绿假单胞菌的MBIC降至单用时的1/8［19］。D-蛋氨酸、D-苯丙氨酸、D-Trp联合应用能够增强金黄色葡萄球菌对利福平的敏感性［14］。D-天冬氨酸、D-半胱氨酸、D-谷氨酸混合物能够提高S.mutans对乳酸链球菌素的敏感性［4］。

CHX作为常用的抗菌药物，可作为含漱剂治疗牙龈炎，亦可用于根管消毒［11］、菌斑控制［20］。口腔中的牙菌斑是由多菌种组成的生物膜，在适当条件下可引起龋病、牙周病等细菌感染相关疾病。本实验结果显示，5.0 mmol/L D-Trp与CHX联合应用S.mutans的MIBC降至单独应用CHX的1/8，表明D-Trp可作用于生物膜形式的S.mutans，协助提高S.mutans生物膜对CHX的敏感性。Tong等［4］未能证实D-AA混合物是否能够提高S.mutans生物膜对CHX的敏感性，可能的原因是所用D-AA不同。结合相关研究，笔者认为通过破坏生物膜的方法，同时降低CHX等抗菌药物的使用浓度，可能成为一种控制菌斑的新方法。

由于不同细菌形成生物膜的机制不同，因此D-AA对生物膜形成和离散的作用机制也不尽相同。研究显示，D-AA可通过影响生物膜基质中肽聚糖的结构、数量和强度［4，13］，增加细菌游动性［21］，干扰胞外脂蛋白的合成［16］等方式抑制生物膜形成。DAA可引起细菌细胞壁淀粉样蛋白的释放，离散成熟的生物膜［22］。

综上所述，D-Trp能够抑制S.mutans生物膜形成，促进已形成生物膜离散，可能成为临床控制菌斑的新方法。然而，目前，D-Trp对S.mutans生物膜的作用机制仍尚未明确，有待进一步研究。

（图3见插页）

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（2016-04-22收稿2016-07-01修回）

（本文编辑陆荣展）

Effects of D-tryptophan on biofilm formation and dispersal in Streptococcus mutans

YANG Xiaoyue1，LIAO Xiaohui2，YE Jing3，SHAO Can1，WANG Bin1，LIU Ying1△
1 Department of Endodontics Dentistry，Hospital of Stomatology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 General Department West Branch of Stomatology Hospital of Zhejiang Province；3 Department of Stomatology，Tianjin Hospital△

ObjectiveTo investigate the effects of D-tryptophan（D-Trp）on the formation of Streptococcus mutans（S.mutans）biofilm and the dispersal of 24 h-old biofilm，and the drug susceptibility of S.mutans against chlorhexidine（CHX）under the role of D-Trp.MethodsOptical density assay was used to evaluate the growth curve of S.mutans exposed to 5.0 mmol/L D-Trp for 28 h.The non-treated group was not added with D-Trp.After treatment with 1.0，2.5 and 5.0 mmol/L D-Trp，crystal violet staining was used to observe the changes of S.mutans biofilm formation in treatment group and nontreatment group.Crystal violet staining and confocal laser scanning microscopy（CLSM）were applied to illustrate the effects of 1.0，2.5 and 5.0 mmol/L D-Trp on the dispersal of 24 h-old S.mutans biofilm.Resazurin sodium was used to indicate the effect of 5.0 mmol/L D-Trp on the minimum inhibitory concentration（MIC）and the minimum biofilm inhibitory concentration（MBIC）of treatment groups and negative control group.ResultsThe growth curves of planktonic S.mutans within 28 h was consistent in treatment group and the non-treated group，both attained exponential phase after 4 h and reached stationary phase at 22 h.Notably，when compared with non-treated group，the biomass of S.mutans biofilm was increased with time from 0 to 72 h after treatment with 1.0，2.5 and 5.0 mmol/L D-Trp.And at the same time point，the biomass was significantly less in each subgroup of treatment group than that of non-treated group（P＜0.05）.Crystal violet staining demonstrated that values of biomass（OD570）were less in treatment groups treated with 1.0，2.5 and 5.0 mmol/L DTrp than those of non-treated group（P＜0.01）.CLSM also showed that bacteria was adhered to the surface of media intreatment groups treated with 1.0，2.5 and 5.0 mmol/L D-Trp.The values of biomass were lower in treatment groups than those of non-treated group（P＜0.01）.The MIC against S.mutans was 0.073 mg/L in both experimental group and negative control group.The values of MBIC were 0.293 mg/L and 2.344 mg/L in experimental group and negative control group，respectively.Under the action of 5.0 mmol/L D-Trp，the MBIC of S.mutans was reduced to 1/8.ConclusionResults indicate that D-Trp may inhibit the formation of S.mutans biofilm and promote the dispersal of biofilm already formed.DTrp may further help CHX exert its bactericidal activity to S.mutans.

Streptococcus mutans；biofilms；Chlorhexidine；microbial sensitivity tests；D-tryptophan；the minimum inhibitory concentration

R781.1

A

10.11958/20160341

1天津医科大学口腔医院牙体牙髓科（邮编300070）；2浙江省口腔医院城西分院综合科；3天津市天津医院口腔科

杨晓月（1991），女，硕士在读，主要从事右旋氨基酸对变异链球菌生物膜形成及离散的研究

△通讯作者E-mail:yingliu04@tmu.edu.cn