武 丽
血管内皮生长因子基因治疗心血管疾病的研究进展
武 丽
血管内皮生长因子(VEGFs)介导的治疗性血管生成成为一种新兴的方法，可以治疗缺血性心血管疾病和其他缺血性疾病。本文通过综述一系列大型动物复制临床相关疾病模型的临床前研究及相关的临床试验，探讨该治疗方法的安全性、可行性和有效性。
心血管疾病；血管再生；血管内皮生长因子；基因治疗
心血管疾病作为世界上发病率最高的慢性非传染性疾病，是人类健康的最大威胁。尽管针对不同的疾病临床有多种治疗方法，但是冠心病、缺血性心肌病、外周血管疾病仍然是临床治疗的难题，尤其是合并有2型糖尿病的患者。将血管再生基因转移至局部缺血心肌和骨骼肌有望成为治疗缺血性心肌病及外周血管疾病的有效方法，特别是对于那些其他治疗方法效果不佳的患者。血管内皮生长因子(VEGF)基因治疗、成纤维细胞生长因子基因治疗和肝细胞生长因子基因治疗已经成为治疗疾病的一种治疗手段[1]。而且这些基于生长因子的基因治疗已进行了重组蛋白试验，从这些试验中获得了大量安全性和毒理性的数据。
1 血管再生治疗
血管再生治疗是指医源性地为缺血部位提供促血管再生的微环境，从而使缺血组织新生毛细血管网。生理学状态下，抑制血管再生的因素多于促进血管再生的因素，使得血管再生无法实现，可以靶向导入促血管再生的因子来打乱这种平衡。血管再生包括两种机制：血管发生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)[2]。血管发生是指在胚胎期，来源于中胚层的干细胞增殖和分化，形成内皮细胞，进而与其他细胞形成原始的心血管系统；而血管新生出现在血管发生之后，是指自体血管以出芽或分支的方式生长出新血管的过程。血管舒张及血管通透性的改变可以引起血管新生。分子、细胞、体液和机械因素等共同导致血管壁自身稳态的破坏，导致内皮细胞增殖、迁移。大量的刺激因子和抑制因子，包括细胞因子、蛋白酶、细胞外基质蛋白质和黏附分子共同参与了这一过程[3]。最初，人们认为血管发生和血管新生是各自独立发生的事件，血管发生仅发生在胚胎发育期，而血管新生可发生于成年人。然而现在认为这两种血管再生机制在同一微环境下共同参与血管再生过程[4，5]，据报道血管发生完成了成人3.5%～25%的血管再生过程。与血管发生及血管新生相比，动脉生成更有临床意义，动脉生成并不是一支全新的血管生成，而是动脉自身形成分支[6]。这说明动脉的结构发生了重塑，部分是由于血管壁剪切力发生了变化，并不完全是由于血管扩张引起的[7]。
而这种剪切力的变化导致内皮细胞释放某种因子，这种因子可以趋化单核细胞到该血管分支处，这些单核细胞产生了大量介导动脉发生的因子[7]。重要部位的缺血性改变，如心肌缺血、肢体缺血，可以通过细胞移植和基因治疗达到治疗性血管再生的目的。
诱导缺血部位长期产生生长因子将会有更加稳定的生物学效应[8，9]，近年来研究的重点已转向基因疗法。基于血管生长因子的基因治疗，是将编码血管生长因子的基因传递到细胞的cDNA中，然后再将其转录到细胞核(转染)。在临床试验中，使用的方法包括直接冠脉内注射、心脏搭桥手术中直接心肌内注射和更为无创的经皮注射，后两种方法可以减少非缺血性组织生长因子水平升高引起的副反应。已使用的有三种不同的基因转染制剂，即裸质粒DNA、脂质体质粒DNA、不同的病毒载体(逆转录病毒、腺相关的病毒或腺病毒)。以质粒DNA或脂质体复合物转染比较简单，但疗效较差，质粒DNA仅有不到1%进入细胞，逆转录病毒是通过细胞表面上的特异性受体进入细胞。逆转录病毒只能转染增殖的细胞，用于缺血性心脏疾病的治疗作用，因为心肌中只有少数细胞处于增殖阶段。此外，逆转录病毒RNA基因组可以整合到宿主DNA中，在随后的细胞增殖所产生的子细胞仍然存在。如果目的是短期启动基因的表达，那么这种整合将有很大的局限性。此外，使用逆转录病毒引起的插入突变也受到普遍关注。腺病毒也是通过特定的细胞表面受体进入细胞，但该基因活化的细胞是独立的增殖细胞，并不整合到宿主基因组中。然而，腺病毒可以诱导免疫和炎性反应，从而可降低基因的活性。腺相关病毒可能是一个更好的载体，因为它诱导的免疫反应更轻，然而，与其他病毒相比，它可以携带的基因长度有限。
2 VEGF基因治疗
VEGF是用于缺血性心脏病血管再生中研究最多的生长因子，VEGF的亚型与血管内皮细胞上的特异性受体结合，在血管生成中发挥重要作用[10]。哺乳动物基因组编码VEGF家族的五种亚型，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGFD和胎盘生长因子[11]。VEGF-A和VEGF-B信号通过VEFGR-1和VEFGR-2来调节血管生理变化[12-15]。VEGF-A[11]在心脏的血管生成中起着关键作用，特别是在缺氧和营养匮乏的情况下[16，17]。在大多数表达VEGF基因的细胞和组织中可以检测到其亚型VEGF-121和VEGF-165。VEGF-121缺乏VEGF基因外显子7编码的氨基酸，而VEGF-165含有该氨基酸，使得VEGF-165能够结合肝素和硫酸肝素。研究发现VEGF-165的基因治疗用于促进血管生成是非常有效的[18]。小鼠体内质粒介导的或在兔体内通过非病毒传递方式介导的VEGF-165基因治疗可以显着地诱导新生血管形成[18-21]。在心肌梗死的猪模型中，VEGF-165能增加心肌血流量，提高壁增厚和应变[22]，改善室壁运动[23]，增加射血分数[24]，增加心肌活性[25]，从而显着改善心脏整体功能。此外，VEGF-121基因治疗增强小鼠心肌梗死后和猪慢性心肌缺血的侧支循环[23，26]。
VEGF- B在富含线粒体的组织中高度表达，如心脏、骨骼肌和棕色脂肪组织[27]以及在缺血心肌的血运重建中起着重要作用[28]。在猪和兔心肌缺血后VEGF-B186的高表达可以改善心肌灌注和射血分数[29]。同样VEGF-C基因治疗增加仔猪心肌缺血后侧支循环形成，减少心室壁增厚[30]。经导管心肌内VEGF-D基因转移治疗可以改善正常猪心肌血流灌注时[31]。总之，这些研究表明，在动物模型中通过基因治疗使VEGF表达的方法能够显着促进血管生成和改善心肌损伤后的心功能。然而血管生成疗法也不是没有缺点，无法调节其表达限制了VEGF基因治疗的疗效和安全性[32-34]。为了克服这个障碍，已开发了新的基因结构，其表达可以视细胞环境开启或关闭。这些基因在缺血心肌中表达更多的VEGF[35，36]，改善梗死部位[37]，诱导血管生成[38]。
3 临床研究
1997年，Laitinen等[39，40]进行了Ⅰ期临床试验研究，将VEGF-A以输液灌注导管注入心肌的治疗方法进行了评估。使用导管的方法是可行的。在这项研究的基础上，进行了Ⅱ期的临床研究发现，通过SPECT扫描发现，基于VEGF的基因治疗可显着改善心肌的代谢功能。然而，自行车测试发现心血管病病死率和运动耐量没有发生改变。在这个试验中基因转移是和血管成形术和支架置入术同时进行的，很有可能已经分散到全身，在心肌浓度很低。经冠状动脉内转移携带VEGF腺病毒的方法安全性比较好[41，42]。最近的一些临床研究使用NOGA导管的方法，在缺血心肌部位经心肌输送携带血管内皮生长因子基因的病毒，这样有针对性的导管输送，可以明显减少病毒使用剂量，同时仍然可以显着覆盖缺血心肌。
基于VEGF血管生成的第一轮研究中并未取得与临床相关的成功结果，对治疗方法、基因转染、生长因子等各方面的改进十分必要。目前，腺病毒载体的生产相对容易，而且GMP级别的基因药物可以大量生产。最大限度地减少靶向导管使用，尽量使用VEGF家族中副反应少、疗效更长久的成员。对治疗后1周心脏功能和血流的短期评价应该能够最大限度地反映转染载体是否有效。正在进行的研究将确定是否这些改进会产生与临床相关的有利结果。
4 问题与展望
一些终末期患者仍然被用于Ⅰ / Ⅱ期的临床研究，目前还不清楚这部分患者人群是否是促血管生成疗法最好的人群。很有可能这些患者的血管生成能力是十分有限的，这与他们本身患有非常严重的疾病是密切相关的。也有可能老年糖尿病患者对促血管生成基因治疗根本不会产生积极的应答反应能力[1，43]。今后的临床试验应该选择患有不严重疾病的患者人群。另外，应该采用基于影像学和可以反映心肌和外周组织代谢的指标[43]。
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(本文编辑 郭怀印)
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A
10．3969/j．issn．1672-1349．2015．10．010
1672-1349(2015)10-1180-03
2014-12-26)
