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上皮性卵巢癌病人外周血循环肿瘤细胞与栓塞的相关性研究

张玲，乔翠峰，杜秀萍

目的利用免疫磁珠法富集上皮性卵巢癌合并静脉血栓(VET)病人外周血循环肿瘤细胞(CTCs)，观察血液CTCs水平与病人静脉血栓的相关性。方法采集2016年1月—2017年1月确诊的62例卵巢癌合并VET病人外周血，应用免疫磁珠法富集上皮性卵巢癌病人的外周血循环肿瘤细胞，研究CTCs水平与病人栓塞的关系。结果62例上皮性卵巢癌合并VET病人47例为CTCs阳性，CTCs阳性率与上皮性卵巢癌病人的年龄、肿瘤部位、TNM分期及纤维蛋白原无关(P>0.05)；与CA125、血小板数量及抗凝血酶Ⅲ密切相关，差异有统计学意义(P<0.05)。结论CTCs监测可能为预测卵巢癌病人静脉栓塞的有效方法。

上皮性卵巢癌；循环肿瘤细胞；栓塞

卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，其主要死因是肿瘤细胞的远处转移及肿瘤相关性栓塞症[1-2]。卵巢癌病人发生静脉血栓栓塞(VTE)包括深静脉血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)的风险较非肿瘤病人高数倍。有文献表明：外周血循环肿瘤细胞高的肿瘤病人血栓风险升高[3-4]。

近年来，新兴循环肿瘤细胞检测技术，可帮助肿瘤病人了解外周血肿瘤细胞情况，尽早预测肿瘤病人发生血栓的可能性。外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指自发或诊疗操作手段由肿瘤原病灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞[5 ]。检测肿瘤细胞相当于“体液活检”，为病人提供重要的病情信息。但CTCs在血液中受到大量正常血细胞干扰，因此需要敏感的CTCs收集鉴定检测手段[6]。上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecular，EpCAM)是一种由GA-733-2基因编码的分子量为40 kDa的跨膜糖蛋白，作为嗜同种的钙非依赖性上皮细胞间黏附分子在上皮癌变过程中发挥作用。本研究采用EpCAM结合超顺磁性免疫磁珠在磁场磁力作用下与其他物质分离，从而收集肿瘤细胞[7]，通过EpCAM免疫磁珠富集法收集上皮性卵巢癌合并VET病人外周血中CTCs，以期了解CTCs水平与卵巢癌病人VET的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集山西省肿瘤医院妇产科2016年1月—2017年1月上皮性卵巢癌病人62例，年龄20岁～60岁，平均42.7岁。纳入标准：病理诊断为上皮性卵巢癌。排除标准：同时合并其他原发恶性肿瘤；未接受手术治疗或手术后未未化疗；未完成整个化疗期周期的。对照组为同期就诊的20例卵巢癌病人，年龄20岁～60岁，平均年龄44.5岁。

1.2 主要试剂 抗EpCAM免疫磁球购于上海美吉生物有限公司，CD45-PE和CK19/FITC标记抗体购于上海瑞齐生物科技有限公司，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diami-no-2-phenylindole，DAPI)购自美国Sigma公司。总胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐(HQCMC)、1，2-二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二氯甲烷、二价铁盐(FeSO4·7H2O)、三价铁盐(FeCl3·6H2O)、NH3·H2O、N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)等常用试剂均购自上海美吉生物有限公司。人卵巢癌细胞株SKOV3购于上海江林生物科技公司。

1.3 循环肿瘤细胞检测方法

1.3.1 标本采集 采血前24 h禁高脂高糖饮食。抽血时病人处于安静状态，空腹，取坐位。从肘正中静脉用EDTA抗凝剂真空采血管抽取全血样本7.5 mL。采血后重新编号，放入4 ℃冰箱暂存，24 h内进行检测。

1.3.2 免疫磁珠富集法 将收集的卵巢癌病人的外周血放至10 mL离心管中，置于离心机中，1 500 r/min离心15 min；离心后，转移上面第一层和第二层内所有液体至 10 mL离心管A中；在离心管A中加等体积磷酸盐缓冲液(PBS)混匀；加入抗EpCAM免疫磁球，孵育1 h，每隔10 min混匀一次；将离心管放在磁力架上，磁分离15 min，丢弃上清，并加1 mL PBS洗涤磁球；滴加CK19-FITC 15 μL，CD45-PE 15 μL，DAPI 25 μL 37 ℃下避光孵育1 h。加2 mL PBS洗涤，磁分离15 min，加入50 μL双蒸水重悬涂片；以对数正常生长的卵巢癌细胞株为阳性对照，以PBS代替抗体作为阴性对照。在荧光显微镜计数肿瘤细胞数并记录结果。

1.3.3 CTCs判定标准 肿瘤细胞体积大于周围白细胞，核较大或小，核浆比例较大，核分裂增多；在荧光显微镜下观察，DAPI(+)、CK19(+)、CD45(-)为CTCs。

1.4 实验室检测指标 纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)、D-二聚体(D-Dimer)、抗凝血酶-Ⅲ(Antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ)采用贝克曼ACL TOP700仪器加IL试剂盒检测，血小板计数(platelet count，PLT)采用贝克曼LH750仪器检测。

2 结 果

2.1 卵巢癌病人CTCs检测结果 对照组外周血中检出CTCs为30.0%(6/20)，卵巢癌合并VET病人外周血中检出CTCs为75.8%(47/62)，两组阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 卵巢癌CTCs免疫荧光染色结果(见图1)

图1 CTCs免疫荧光染色结果

2.3 卵巢癌CTCs与各指标的相关性 CTCs阳性率与上皮性卵巢癌病人的年龄、肿瘤部位、TNM分期及纤维蛋白原无关(P>0.05)；而与CA125、血小板数量及抗凝血酶Ⅲ密切相关，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 卵巢癌CTCs与各指标的相关性 例

3 讨 论

CTCs是存在于外周血中的各类肿瘤细胞统称，由于自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTCs进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数转移至其他器官发展成为转移灶或形成局部血栓[8]。外周血肿瘤细胞是导致血栓的重要原因[9]。监测肿瘤细胞的变化成为人们研究的焦点。

大量文献表明，CTCs与肿瘤的转移和血栓形成有关[10-11]。病人CTCs水平越高，远处转移和复发风险越大，同时高水平循环肿瘤细胞CTCs易形成血栓。卵巢癌病人监测CTCs不仅可帮助临床医生发现早期肿瘤，指导临床化疗药物的应用，还可及时预防复发和肿瘤性血栓[12]。

本研究观察62例卵巢癌合并VET病人，47例为CTCs阳性，统计分析显示，CTCs阳性率与上皮性卵巢癌病人的年龄、肿瘤部位、TNM分期及纤维蛋白原无关(P>0.05)；而与CA125、血小板数量及抗凝血酶Ⅲ密切相关，差异有统计学意义(P<0.05)，结果显示，CTCs与卵巢癌病人血栓的风险正相关。本研究CTCs阳性率与病人的纤维蛋白原无关，而在实际临床工作中，CTCs阳性率高及纤维蛋白原高的病人更易发生血栓，这可能与临床样本量较少有关。因此，CTCs与卵巢癌病人血栓可能性的相关性还需更多大样本量及多中心的临床试验进一步验证。

综上所述，CTCs水平与卵巢癌病人栓塞密切相关。监测外周血CTCs有望成为预测卵巢癌病人静脉栓塞的可靠指标。

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(本文编辑薛妮)

山西省妇幼保健院(太原 030001)

杜秀萍，E-mail：13835121498@163.com

信息：张玲，乔翠峰，杜秀萍.上皮性卵巢癌病人外周血循环肿瘤细胞与栓塞的相关性研究[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(17)：2219-2221.

R737.3 R271

：Bdoi：10.3969/j.issn.1672-1349.2017.17.044

：1672-1349(2017)17-2219-03

2017-07-25)