半夏白术天麻汤“异病同治”高血压、高脂血症、眩晕的网络药理学研究

赵焕东,丁瑞敏

高血压是指以体循环动脉血压增高为主要特征,伴有心、脑、肾等器官功能或器质性损害的疾病,是世界范围内心血管疾病和过早死亡的主要原因[1]。根据调查研究显示,我国18岁以上成年人高血压患病率为23.2%(约2.445亿例),随着城镇化及人们生活方式改变,高血压患病率呈升高趋势[2]。高脂血症是由各种原因导致血浆总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低的全身脂代谢异常疾病。调查结果显示,近30年来,我国人民血脂水平逐步升高,成人血脂异常总体患病率为40.40%,并呈年轻化趋势[3]。2017年全球疾病负担研究显示,LDL-C水平升高是我国心血管疾病的第3位危险因素,仅次于高血压、高钠饮食[4]。眩晕是临床常见的症状,随着年龄的增长病人患病率增加,是老年人就诊的主要原因,眩晕发病与大脑的前庭病变和中枢神经系统等疾病有关[5]。高血压、高脂血症、眩晕密切联系、相互存在,不断影响我国居民的生活质量。中医学将高血压归属于“眩晕”“头痛”范畴,高脂血症归属于“膏浊”“眩晕”“血浊”“血瘀”等范畴[6],两病病因多为先天禀赋、饮食劳伤、年老体衰,以虚实夹杂证多见[6-7],眩晕多为主要症状。现代医学治疗高血压、高脂血症、眩晕的方法日益成熟,仍存在药物导致的安全性风险[8-9]。

半夏白术天麻汤出自《医学心悟·眩晕》[10],书中记载:“眩,谓眼黑;晕者,头旋也。有湿痰壅遏者,头旋眼花,半夏白术天麻汤主之”。该方燥湿化痰、平肝熄风,可治风痰上扰所致眩晕头痛、胸闷呕恶等症。临床研究显示,半夏白术天麻汤“异病同治”高血压、高脂血症、眩晕等,具有较好的临床疗效[11-13]。基础研究显示,半夏白术天麻汤通过上调miRNA-217,促进内皮细胞增殖,发挥保护内皮的作用;通过下调基质金属蛋白酶9(MMP-9)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL6),减少炎症反应,降低人氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、丙二醛(MDA)水平,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,发挥改善动脉粥样硬化的作用[14-15]。由于多数研究只针对该方治疗单一疾病,该方的“异病同治”机制、具体活性成分和作用靶点尚未明确。网络药理学是一门基于系统生物学和生物信息学的新型学科,从分子水平阐明药物的作用机制,其综合性、系统性、整体性理念与中医多组分、多靶点、多途径的特点是一致的。本研究基于网络药理学的方法[16],从分子水平阐明该方药物的协同作用机制,解释药物与机体之间的复杂关系,推测“异病同治”机制,以期为今后基础实验和临床研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 药物与疾病靶点的收集 通过TCMSP数据库(https://tcmspw.com/)[17]和BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)筛选半夏、天麻、茯苓、橘红、白术、甘草活性成分,设置参数为口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18、Score≥20。通过SwissTargetPrediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/),并预测靶点的活性成分。通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)[18]以“hypertension”“hyperlipemia”“dyslipidemia”“vertigo”为检索词收集疾病靶点。通过韦恩图获取药物和疾病“异病同治”靶点。研究流程见图1。

图1 研究流程图

1.2 “异病同治”靶点蛋白-蛋白互作(PPI)网络的构建 通过STRING平台(https://string-db.org/)[19],对“异病同治”靶点进行PPI分析,将计算结果导入Cytoscape 3.8.2软件进行网络拓扑分析,使用cytoHubba插件筛选关键靶点。通过BioGPS(http://biogps.org)获取关键靶点在人体器官组织内的分布,将结果导入Cytoscape 3.8.2软件进行网络拓扑分析,绘制关键靶点-器官组织网络图。

1.3 “异病同治”靶点富集分析 通过Metascape数据库(https://metascape.org/)对“异病同治”靶点进行基因本体(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,GO功能富集分析主要包括分子功能、细胞组分、生物过程。采用R语言等软件对富集分析数据进行气泡图和柱状图的可视化处理。整合药物与疾病靶点、“异病同治”靶点的相关数据,进行“半夏白术天麻汤异病同治机制网络图”的绘制,使用cytoHubba插件筛选关键成分。

1.4 分子对接分析 选取部分关键靶点与关键成分进行分子对接分析,关键靶点通过PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取,其中关键成分结构通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取。利用PyMOL软件、AutoDock Vina软件,进行分子对接,之后绘制分子对接结合能热图与分子对接图。

2 结 果

2.1 药物与疾病靶点收集 共收集中药活性成分99个、药物靶点847个、高血压靶点2 773个、高脂血症靶点1 512个、眩晕靶点933个。按OB值大小绘制居前20位的活性成分,详见表1。对药物靶点与疾病靶点取交集,得到“异病同治”交集靶点65个。详见图2。

表1 主要活性成分

图2 药物与疾病靶点韦恩图

2.2 PPI网络分析 通过STRING平台对“异病同治”靶点进行PPI处理,利用Cytoscape将得到的数据进行网络拓扑分析(见图3),得到64个节点、604条边,平均度值(Degree值)为18.9,度值大小与颜色、图形大小成正比。根据PPI网络图可知关键靶点主要为白蛋白(ALB)、丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1)、IL6、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、胱天蛋白酶3(CASP3)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、雌激素受体1(ESR1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)。详见表2。

表2 排名前20位的关键靶点信息

图3 关键靶点的PPI网络图

通过BioGPS数据库对排名居前20位的关键靶点进行分析,获取关键靶点在人体器官组织内的分布,绘制关键靶点-器官组织网络图。详见图4。其中肝(liver)、心(heart)、甲状腺(thyroid)、视网膜(retina)、松果体(pineal)、杏仁体(amygdala)、CD33+_骨髓(CD33+_myeloid)、全血(whole blood)排名居前列。

图4 关键靶点-器官组织网络图

2.3 “异病同治”靶点富集分析 通过Metascape数据库对“异病同治”靶点进行基因富集分析,在对富集项进行层次聚类时,使用Kappa scores作为相似度度量,相似度为>0.3被视为一个集群,在一个聚类中选择重要的项目表示该聚类。结果显示,共富集316个生物过程条目,包括循环系统过程(circulatory system process)、蛋白磷酸化正调控(positive regulation of protein phosphorylation)、细胞对有机氮化合物的反应(cellular response to organonitrogen compound)、细胞钙离子稳态(cellular calcium ion homeostasis)、血压负调节(negative regulation of blood pressure)等;80个分子功能条目,包括神经递质受体的活动(neurotransmitter receptor activity)、G蛋白偶联胺受体活性(G protein-coupled amine receptor activity)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、胺结合(amine binding)等功能;得到83个细胞组分条目,涉及膜筏(membrane raft)、受体复合物(receptor complex)、质膜的外侧面(membrane)等结构。根据count值绘制GO分析图(见图5)。共富集179条KEGG通路,对排名居前15位的KEGG通路进行可视化处理(见图6),包括晚期糖基化终产物(AGE)-晚期糖基化终产物受体(RAGE)糖尿病并发症信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)通路、辅助性T细胞17(Th17)细胞分化、环磷酸腺苷(cAMP)通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、脂肪细胞中脂肪分解的调节、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)通路、核因子κB(NF-κB)通路、炎症介质对色氨酸通道的调节等。

图5 GO富集分析柱状图

图6 KEGG通路富集气泡图

2.4 半夏白术天麻汤“异病同治”机制网络图 绘制半夏白术天麻汤“异病同治”机制网络图,详见图7。该图包括214个节点、1 180条边,平均Degree值为11,包含93个活性成分、65个靶点、10个生物过程、细胞组分、分子功能条目,15个KEGG条目。由图可知,半夏白术天麻汤“异病同治”高血压、高脂血症、眩晕的作用机制为通过卡文定碱(cavidine)、黄甘草异黄酮A(eurycarpin A)、柚皮素(naringenin)、甘草查尔酮B(licochalcone B)、山柰酚(kaempferol)、黄芩素(baicalein)等关键成分(见表3),与ALB、AKT1、IL6、TNF、VEGFA等关键靶点相结合,进而调控循环系统、蛋白磷酸化正调控、细胞钙离子稳态、血压负调节等生物过程及调节HIF-1通路、Th17细胞分化、cAMP通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、脂肪细胞中脂肪分解的调节、PPAR通路、NF-κB通路等。

表3 关键成分

图7 半夏白术天麻汤“异病同治”机制网络图

2.5 分子对接分析 选取ALB、AKT1、IL6、TNF、VEGFA为分子对接的蛋白,选取卡文定碱、黄甘草异黄酮A 、柚皮素、甘草查尔酮 B、山柰酚为结合配体。结果显示,对接结合能均≤-25.1 kJ/mol(详见图8),其中黄甘草异黄酮A、柚皮素与AKT1对接最稳定,均为-40.2 kJ/mol。使用PyMOL绘制分子对接图(见图9),图中青色化合物为配体,蓝色化合物为氨基酸残基,黄色虚线为氢键。可见半夏白术天麻汤“异病同治”关键成分与关键靶点能结合稳定。

图8 分子对接结合能

图9 分子对接三维图

3 讨 论

“异病同治”思想起源于《黄帝内经》,丰富于《金匮要略》,反映了中医诊治疾病着眼于辨析证候与因证而治的特点,体现了中医辨证论治思想的精髓[20-21]。半夏白术天麻汤以半夏、天麻为君,半夏燥湿化痰、降逆止呕;天麻息风止痉、平抑肝阳,两药合用,可治风痰眩晕头痛。白术、茯苓健脾祛湿,可绝生痰之源,为臣药。橘红理气化痰、气顺痰消,为佐药。甘草调和诸药,为使药。诸药合用,风息痰消,眩晕自愈。高血压、高脂血症、眩晕常以痰浊内阻证为主[22-23],半夏白术天麻汤健脾化痰,契合三病的病机,是“异病同治”的经典名方。

本研究通过生物信息学的方法,探讨了半夏白术天麻汤“异病同治”高血压、高脂血症、眩晕的作用机制。PPI结果显示,ALB、AKT1、IL6、TNF、VEGFA为关键靶点。ALB是占整个血清体成分一半以上的蛋白质,具有胶体渗透效应、抗炎、抗氧化、抗凝等活性,ALB与心血管疾病存在一定的关联,相关研究显示,ALB可结合类二十烷酸和一氧化氮,从而调节血管张力,并抑制与动脉粥样硬化和血栓形成密切相关的血小板聚集[24-26]。蛋白激酶AKT1参与细胞凋亡和葡萄糖代谢等细胞过程,基础研究发现,AKT1通过调节巨噬细胞的CD36表面丰度,控制体外和体内的动脉粥样硬化和泡沫细胞形成[27],AKT1可调节血管平滑肌细胞增殖、迁移,缺失的AKT1可诱导斑块易损性和心脏功能障碍[28]。IL6、TNF是参与多种生理与免疫过程的促炎细胞因子,参与高血压、动脉粥样硬化、血脂异常等心血管疾病的发展[29-30]。临床研究发现,TNF-α和IL6水平与妊娠高血压及不良妊娠结局呈正相关[31-32]。VEGFA是一种内皮生长及血管通透性的调节因子,可增强内皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)通路表达,促进血管通透性和内皮细胞存活,通过磷酸肌醇特异性磷脂酶Cγ(PLCγ)/蛋白激酶C(PKC)激活磷脂酶A2,促进前列环素I2(PGI2)产生,达到扩血管的目的[33]。为了进一步预测具有关键靶点作用的器官组织,本研究通过BioGPS分析,结果显示,关键靶点主要集中于肝、心、视网膜、松果体、甲状腺等器官组织,契合高血压、高脂血症、眩晕以心、肝为主的病位。

本研究基因富集分析结果显示,靶点基因主要富集在循环系统、蛋白磷酸化正调控、细胞钙离子稳态、血压负调节等生物过程及HIF-1通路、cAMP通路、PPAR通路等信号通路。HIF通路参与机体氧稳态平衡,诱导控制葡萄糖代谢、细胞增殖和血管形成的蛋白质表达[34],在低氧条件下,HIF-1通过上调NF-κB、血管内皮生长因子(VEGF)、活性氧和诱导型一氧化氮合酶(iNOS),导致内皮细胞功能障碍、迁移和增殖,从而促进动脉粥样硬化的进展[35]。cAMP通路在细胞对细胞外刺激的反应中发挥着重要作用,有研究显示,流体剪切应力通过增加体内cAMP水平,提高eNOS结合度,从而促进NO形成并调节血管张力和血压[36]。PPAR通路在葡萄糖和脂质代谢中发挥着关键作用,PPAR是炎症、高血压和动脉粥样硬化重要的治疗靶点[37]。PPARα通过增强脂肪酸摄取,增加水解脂蛋白三酰甘油的脂蛋白脂肪酶(LPL)活性,减少血浆富含三酰甘油的脂蛋白。PPARα和PPARγ通过抑制促炎基因的表达发挥抗炎作用[38]。

半夏白术天麻汤“异病同治”机制网络图显示,卡文定碱、黄甘草异黄酮A 、柚皮素、甘草查尔酮 B、山柰酚为“异病同治”的关键成分。卡文定碱是一种异喹啉生物碱,可调节SOD、MDA、NF-κB的表达,抑制血清TNF-α和IL6水平,是具有抗炎活性的选择性环氧合酶2(COX-2)抑制剂[39-40]。柚皮素是一种常见的黄酮类化合物,具有抗炎、降血脂作用[41],可降低LDL-C和三酰甘油,抑制葡萄糖摄取;增加高密度脂蛋白胆固醇,抑制蛋白质氧化,防止细胞间黏附,达到抗动脉粥样硬化的目的[42]。甘草查尔酮 B具有抗炎、抗癌、抗菌生物活性[43],通过降低MDA、TNF-α和C反应蛋白水平及IL8和IL6的活性,达到保护心脏的目的[44]。山柰酚是广泛分布于植物界的黄酮类化合物,具有抑制血管内皮炎症、保护心脏的功能,通过增加核红细胞2相关因子2(Nrf2)的表达,抑制Toll样受体4(TLR4)表达,发挥抗炎作用[45-46], 山柰酚通过增加肝脏PPARα水平,调节高脂饮食喂养大鼠的脂质谱,从而改善高脂血症[47]。分子对接结果显示,关键成分与关键蛋白的构象稳定,说明二者可结合起效。

综上所述,半夏白术天麻汤“异病同治”高血压、高脂血症、眩晕的机制可能为关键成分通过多靶点、多通路,发挥抑制炎症、降低血脂、扩张血管等作用。