基于网络药理学与分子对接探讨失笑散治疗冠心病的作用机制

邵 鑫,朱云鹏,王 彦

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病,是由于冠状动脉粥样硬化引起管腔狭窄、阻塞或痉挛,导致心肌缺血、缺氧引起的心脏病[1],是临床常见的心血管疾病之一。中医学将冠心病归属于“胸痹”“真心痛”“心悸”等范畴,相关研究证实中成药在缓解心绞痛、防治再灌注后无复流、心肌梗死二级预防及提高生活质量等方面有独特的优势[2]。

失笑散源自宋代《太平惠民和剂局方》,由蒲黄和五灵脂等组成[3],具有活血祛瘀、散结止痛之效,主治瘀血内停、脉道阻滞所致之痛症。现代药理学研究显示,失笑散具有抗心肌缺血缺氧、抗动脉粥样硬化、抗凝、降压、降脂、镇痛等作用[4-6]。中药复方治疗具有多成分、多靶点、多途径的特性,但其治疗冠心病的潜在作用机制尚未明确。网络药理学是以系统生物学理论为基础,融合了药理学等多学科的内容和技术以阐明药物的作用机制,其整体性、系统性及注重药物成分间相互作用的特性与中医治疗疾病的基本观念相符,可为优化和评价中药复方的临床疗效提供参考依据[7-8]。本研究通过网络药理学“多成分-多靶点-多通路”的分析优势结合分子对接技术探讨失笑散治疗冠心病的潜在作用机制。

1 资料与方法

1.1 失笑散活性成分及作用靶点的筛选 基于中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php/)检索蒲黄的化学成分,以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为条件筛选出蒲黄的有效活性成分,进一步通过TCMSP数据库检索蒲黄活性成分对应的潜在靶点信息,去除不含有靶点的活性成分。利用BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)检索五灵脂的活性成分及作用靶点,设置Score cutoff≥39、P≤0.05进行筛选。借助HERB数据库(http://drug.ac.cn/)搜索五灵脂的活性成分,结合BATMAN-TCM数据库查询靶点以具有对应潜在靶点及OB(≥30%)为限进行补充。利用UniProt蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)设置“Reviewed”,且物种为“Human”,查询潜在靶点对应的基因名并进一步规范,将蒲黄和五灵脂的潜在靶点合并去重。

1.2 构建药物-活性成分-潜在靶点网络图 将整理后的药物、活性成分、潜在靶点信息导入Cytoscape 3.9.0软件中进行可视化分析。利用“源节点(source node)”表示药物和活性成分,“边(dege)”表示节点之间的相互联系,“靶节点(target node)”表示活性成分和潜在靶点,从而构建药物-活性成分-潜在靶点网络图。

1.3 冠心病相关靶点及其与药物靶点交集的获取 以“coronary heart disease”作为关键词在GenenCards基因信息数据库(https://www.genecards.org/)中进行检索,其中Score值代表靶点与疾病的关联程度,Score值越高提示关联越密切。去除Score值较低的靶点,选取Score值>5.9的靶点。借助在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM,https://omim.org/)、治疗靶标数据库(TTD,https://cn.bing.com/)以“coronary heart disease”作为关键词进行补充最终得到冠心病相关靶点。利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将失笑散的潜在靶点与冠心病相关靶点取交集,得到交集靶点。

1.4 蛋白-蛋白互作(PPI)网络的构建 将疾病与药物的交集靶点导入STRING在线平台(https://string-db.org/),物种设置为“Homo sapiens”,设定最低相互作用阈值为最高置信度“highest confidence(0.9)”,隐藏孤立节点,其余参数保持默认设置,得到PPI网络图。将其结果保存为“TSV”模式并导入Cytoscape 3.9.0软件中,运用“Network Analyzer”功能进行网络拓扑学分析,并基于拓扑学参数度值(Degree值)绘制PPI网络图,将Degree值>20作为筛选条件筛选出核心靶点。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 基于Metascape数据平台(https://metascape.org/)对失笑散治疗冠心病的潜在靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析,物种选定为“人”,其余参数保持默认值,借助R语言4.0.2对排名居前20位的结果进行可视化分析。

1.6 构建活性成分-潜在靶点-关键通路网络图 将活性成分、潜在靶点及排名居前20位的关键通路信息导入Cytoscape 3.9.0软件中构建活性成分-潜在靶点-关键通路网络图。并进行拓扑学分析,选取Degree值>10的活性成分作为核心成分。

1.7 分子对接分析 为进一步验证核心成分与核心靶点结合的活性,将分析筛选出的失笑散治疗冠心病的核心成分及核心靶点通过AutoDockTools-1.5.7进行分子对接。具体步骤:①失笑散治疗冠心病的核心靶点及核心成分结构的获取:利用TCMSP及PubChem开放化学数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载核心成分的结构式(mol2格式),借助药物综合数据库(PDB,https://www.rcsb.org)获取核心靶点的3D蛋白结构。②分子对接前预处理:通过PyMOL软件对蛋白质进行去除水分子、移除配体、离子等。③核心成分(配体)与核心靶点(分子)的对接:利用AutoDockTools-1.5.7对靶点蛋白进行加氢、计算电荷、添加原子类型,对核心成分进行设置加氢、可扭转键、计算电荷。使Grid Box网格笼罩整个靶点蛋白,之后进行多次半柔性对接,对接结果只保留对接结合能绝对值最高者。④对接结果可视化:通过PyMOL软件进行可视化分析。

2 结 果

2.1 蒲黄、五灵脂的活性成分及对应潜在靶点 经过TCMSP数据库筛选出蒲黄的潜在化学成分8个(其中棕榈酸睾酮及山柰酚-3-O-α-D-槐糖苷未发现相对应满足条件的靶点予以去除)。通过BATMAN-TCM数据库检索五灵脂获得7个潜在活性物质(其中4′-联苯酚未发现满足条件的靶点予以去除),结合HERB数据库检索进行补充,满足条件的只有尿嘧啶。最终获得失笑散治疗冠心病活性成分13个,其中蒲黄6个、五灵脂7个。详见表1。通过TCMSP、BATMAN-TCM数据获得蒲黄对应潜在靶点326个、五灵脂对应潜在靶点94个,经过合并去重筛选后共获得失笑散治疗冠心病潜在靶点267个。

表1 失笑散活性成分及对应的潜在靶点信息

2.2 药物-活性成分-潜在靶点可视化网络图 将失笑散中蒲黄、五灵脂两味药与筛选出的13个活性成分及267个潜在靶点导入Cytoscape 3.9.0软件中构建药物-活性成分-潜在靶点网络图,详见图1。网络中共282个节点、429条边,平均Degree值为3.021,根据拓扑属性分析显示,槲皮素、异鼠李素、山柰酚、花生四烯酸、β-谷甾醇、尿嘧啶的连接度较高,可能为失笑散治疗冠心病的关键活性成分。

图1 药物-活性成分-潜在靶点网络图

2.3 疾病相关靶点及药物-疾病交集靶点 通过GeneCards数据库检索“coronary heart disease”获得冠心病相关靶点7 682个,OMIM数据检索获得555个,TTD数据库检索出9个。合并去重后共获得冠心病相关靶点3 470个。将其与失笑散活性成分靶点导入Venny 2.1.0取交集共获得179个交集靶点,详见图2。

图2 药物-疾病靶点Venny图

2.4 药物-疾病共同靶点的PPI网络 将获得的179个交集靶点导入STRING数据库中获取相互作用关系网络,详见图3。将获取到TSV格式文件导入Cytoscape 3.9.0软件中基于Degree值绘制PPI网络图,节点越大,颜色越深,提示Degree值越高,表明该靶点联系紧密进而说明靶点的重要性,详见图4。利用Network Analyzer进行网络拓扑学分析。PPI网络中共151个节点、494条边,平均Degree值为6.859。其中Degree值>20的相关信息见表2。

图3 PPI网络关系图

图4 PPI网络图

表2 PPI网络中核心靶点拓扑参数

2.5 GO功能富集及KEGG通路富集分析 为进一步阐明交集靶点的潜在作用机制,将交集靶点上传至Metascape数据平台进行GO功能富集及KEGG通路富集分析。选取排名前20位的条目,利用R语言绘制GO及KEGG富集分析气泡图。其中纵坐标代表基因名称,横坐标表示基因比例(GeneRatio),气泡越大代表基因富集数量越多,颜色越深代表富集程度越显着(即P值越小)。富集结果见图5～图8。其中主要富集的通路包括环磷酸腺苷(cAMP)信号通路、核转录因子(NF)-κB信号通路等。cAMP信号通路属于环核苷酸系统。此系统中,细胞外信号与相应受体结合后,通过腺苷酸环化酶调节cAMP引起反应。NF-κB信号通路的表达是保持细胞增殖并保护细胞免受细胞凋亡的条件。细胞内cAMP的表达可抑制NF-κB的活性,从而抑制肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α),同时增加抗炎因子白细胞介素(IL)-10的产生,阻断了炎性介质释放,从而保护心肌细胞。由此表明失笑散通过调节多种生物学过程、通过多通路治疗冠心病,且各通路之间存在着相互联系。

图5 GO生物过程富集分析气泡图

图6 GO分子功能富集分析气泡图

图7 GO细胞组分富集分析气泡图

图8 KEGG通路富集分析气泡图

2.6 活性成分-潜在靶点-关键通路网络图 将失笑散活性成分、潜在靶点及KEGG筛选出排名居前20位的通路信息导入Cytoscape 3.9.0软件中构建活性成分-潜在靶点-关键通路网络图,详见图9。运用Network Analyzer进行网络拓扑学分析,依据Degree值表示,其中节点越大,颜色越深,提示Degree值越高,表明联系越紧密。网络中有节点212个、边879条,平均Degree值为8.362。选取Degree值>10的活性成分作为核心成分,包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、花生四烯酸、尿嘧啶。

图9 活性成分-潜在靶点-关键通路网络图

2.7 分子对接验证 将Degree值排名前4位(即Degree值>30)的核心靶点与核心成分进行分子对接,详见图10。分子对接可快速评估配体与蛋白质受体的亲和力和结合模式的能力[9],通常认为结合能<0提示配体与受体可自发结合[10],结合能数值越小提示两者越容易结合,结合越稳定。当结合能<-20.93 kJ/mol时提示结合活性较好,结合能<-29.30 kJ/mol时提示极易结合[11]。对接结果显示结合能<-20.93 kJ/mol的共14种,占总数的75%,说明多数核心成分与核心靶点具有良好的结合活性。其中β-谷甾醇与AKT1、HSP90AA1、MAPK1,HSP90AA1与山柰酚,槲皮素与HSP90AA1、MAPK1结合活性较好。运用PyMOL软件对分子对接结果进行可视化分析。详见图11。

图10 分子对接结合能热图

图11 失笑散核心成分与核心靶点的分子对接可视化图

3 讨 论

《金匮要略》记载:“夫脉当取太过不及,阳微阴弦,即胸痹而痛,所以然者,责其极虚也”,张仲景认为此为本虚标实之证。《素问·痹论》云:“心痹痛者,亦有顽痰死血”,明代王肯堂《证治准绳·心痛胃脘痛》记载:“死血作痛,脉必涩”。意在指明瘀血阻络、脉道不通可发为胸痹心痛。相关研究表明,血瘀贯穿冠心病心绞痛的始终[12]。国医大师邓铁涛教授的“五脏相关、痰瘀相关”理论认为痰瘀络阻是冠心病的根本病机[13]。国医大师雷忠义结合《内经》善从瘀血论治冠心病,创新性地提出从痰瘀互结诊治冠心病[14]。

失笑散最早出自宋代《太平惠民和剂局方》,自宋代以后《景岳全书》《血证论》《医学衷中参西录》等经典着作中常有记载,主治病症为后腹痛、心痛、产后心痛等。现代药理研究显示,失笑散具有抗心肌缺血和缺氧、抗动脉粥样硬化、抑制血小板聚集等功能[15]。失笑散全方由蒲黄、五灵脂组成,其中蒲黄具有降低血脂、修复血管内皮细胞、抗动脉粥样硬化的作用[16];五灵脂对血小板聚集、动脉粥样硬化及炎症有良好的治疗效果[17-18]。

本研究基于网络药理学筛选出核心成分,包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、异鼠李素、花生四烯酸、尿嘧啶。其中槲皮素为黄酮类化合物,可抑制血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)活性,具有舒张血管、抗心肌缺血缺氧及延缓动脉硬化发展的作用[19-20]。槲皮素可抑制TNF-α诱导的心肌成纤维细胞增殖及心肌肥厚,减小血管脆性,增加冠状动脉血流量等作用[21]。山柰酚可激活哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路,促进缺氧心肌细胞增殖,抑制其凋亡,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低活性氧水平,抑制自噬,说明山柰酚对心脏有保护作用[22]。β-谷甾醇可抑制心肌缺血再灌注损伤,可能与细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2信号通路有关[23]。异鼠李素具有保护血管内皮细胞、抑制脂肪分化、抗动脉粥样硬化、抗血栓、降血压、降血脂及抑制心肌肥大等冠心病获益的作用[24]。相关文献研究表明,花生四烯酸可开通三磷酸腺苷(ATP)敏感性钾通道,从而舒张血管,并可改善冠状动脉微循环,促进血管生成以保护心肌,同时可抑制NF-κB激活以达到抗动脉粥样硬化及抗炎的目的[25]。

本研究PPI网络分析显示,核心靶点涉及AKT1、p53、HSP90AA1、MAPK1、RELA、JUN、TNF、ESR1、RXRA。其中AKT1通过多种途径影响心血管疾病,包括抗动脉粥样硬化、抗血管生成及成熟、调节血管通透性[26]。AKT1可抑制IL-6表达,从而改善心肌氧化应激、炎症反应、纤维化等,也可抑制新生内膜细胞凋亡与内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的激活,在血管重塑中发挥着保护作用[27]。TNF-α是前炎症细胞因子,可刺激细胞产生IL-17与IL-1,最终造成炎症细胞募集,同时TNF-α抑制心肌收缩过程中β受体活性及Ca2+的转运,引起心肌细胞及间质结构改变,从而进一步加剧心肌损伤坏死[28]。p53在抑制血管生成等方面发挥着重要作用,相关实验显示,p53可加重缺血再灌注过程中心肌损伤,p53参与调节血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)内皮细胞的凋亡[29]。MAPK1作为重要的炎症指标,参与冠心病的炎症反应,可调控凝血功能及脂代谢。MAPK1可影响mTOR信号传导,从而影响内皮细胞自噬能力,增强细胞活力,抑制细胞凋亡,因而对冠心病的发展产生影响[30]。分子对接验证显示,多数核心成分与核心靶点具有良好的结合能。

通过KEGG富集分析结果可知,失笑散治疗冠心病的潜在靶点,主要富集在cAMP信号通路、脂质和动脉粥样硬化、NF-κB信号通路、缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路等。其中cAMP信号通路上游部分相对简单,但其下游部分影响的组织、细胞类型广泛。cAMP作为第一个被识别的“第二信使”,通过刺激eNOS信号通路,可提高心肌细胞收缩力,增加心排血量[31-32]。低密度脂蛋白胆固醇可附着在血管壁内,通过氧化修饰形成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL),进而损伤内皮功能。动脉粥样硬化使动脉壁变厚、变硬,血管管腔越来越狭窄,进而导致心肌缺血缺氧。NF-κB信号通路作为一种炎症通路,通过自噬稳定斑块。NF-κB自噬可防止右心室收缩压、右心室肥厚指数增加及肺动脉重塑。NF-κB自噬可降低IL-6等炎性因子表达以减轻炎症反应,同时减轻内皮损伤以延缓动脉粥样硬化的进程[33]。有研究表明,HIF-1通路在缺氧条件下可激活下游血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、内皮素1、诱导型一氧化氮合酶2等靶基因的转录,从而促进血管内皮细胞分裂和增殖、血管再生及细胞厌氧代谢等,以提高ATP的合成,促进心肌血管新生,改善心功能[34]。

综上所述,失笑散治疗冠心病的机制具有多成分、多靶点、多通路的特点。本研究基于网络药理学及分子对接技术揭示了失笑散的物质基础,为治疗冠心病的可能机制提供了研究思路及理论基础。然而基于中药作用的复杂性及网络药理学的局限性,有待今后药理实验验证。