白银雪 张夏夏 吴丹丹 任珊 安冬青
摘要 目的：探讨天香丹对动脉粥样硬化小鼠嘌呤能配体门控离子通道7（P2X7）、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）的影响。方法：选取8周龄无特定病原体（SPF）级雄性载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠30只，予以高脂饲料喂养12周，造模成功后随机分为模型组、阿托伐他汀组、天香丹组，每组10只；另选取C57BL/6J小鼠10只予普通饲料喂养，设为空白对照组。酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清白细胞介素（IL）-18、IL-1β、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的水平；免疫组化检测组织中P2X7、NLRP3的表达。结果：ELISA结果显示：与空白对照组相比，模型组IL-18、IL-1β、ATP水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，阿托伐他汀组、天香丹组IL-18、IL-1β、ATP水平降低（P＜0.05）。免疫组化结果显示：与空白对照组相比，模型组P2X7、NLRP3表达均明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，阿托伐他汀组、天香丹组P2X7、NLRP3表达均明显降低（P＜0.05）。结论：天香丹改善动脉粥样硬化与调节钾稳态抑制炎症小体的激活有关。
关键词 动脉粥样硬化；天香丹；核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3；嘌呤能配体门控离子通道7；腺嘌呤核苷三磷酸；实验研究
doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.07.010
The Effect of Tianxiangdan on Atherosclerosis by Inhibiting P2X7/NLRP3 Expression
BAI Yinxue， ZHANG Xiaxia， WU Dandan， REN Shan， AN Dongqing
Xinjiang Medical University， Key Laboratory of Xinjiang Famous Physicians and Characteristic Prescriptions， Urumchi 830054， Xinjiang， China
Corresponding Author AN Dongqing， E-mail： andongqing3@gmail.com
Abstract Objective：To investigate the effect of Tianxiangdan on purinergic ligand-gated ion channel 7（ P2X7 ） and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3（ NLRP3） in atherosclerotic mice.Methods：Thirty 8-week-old SPF male ApoE-/- mice were selected and fed with high-fat diet for 12 weeks.After successful modeling，they were randomly divided into model group，statin group，and Tianxiangdan group，with 10 mice in each group.Ten C57BL/6J mice were fed with normal diet as blank control group.The levels of interleukin（IL）-18，IL-1β，and adenosine triphosphate（ATP） in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression of P2X7 and NLRP3 in tissues was detected by immunohistochemistry.Results：ELISA results displayed that compared with the blank group，the levels of IL-18，IL-1β，and ATP in model group increased（P＜0.05）.Compared with the model group，the levels of IL-18， IL-1β，and ATP in statin group and Tianxiangdan group decreased（P＜0.05）.The results of immunohistochemistry showed that the expression of P2X7 and NLRP3 in model group was significantly higher than that in blank group（ P＜0.05）.The expression of P2X7 and NLRP3 in the statin group and Tianxiangdan group decreased compared with the model group（P＜0.05）.Conclusion：The improvement of atherosclerosis by Tianxiangdan is related to regulating potassium homeostasis and inhibiting the activation of inflammasome.
Keywords atherosclerosis; Tianxiangdan; nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3; purinergic ligand-gated ion channel 7， P2X7; adenosine triphosphate; experimental study
动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）是心血管疾病的重要病理基础，是全世界心血管疾病死亡的重要
基金项目 国家自然科学基金项目（No.82060861）；新疆维吾尔自治区重点实验室项目（No.2020D04006）；新疆维吾尔自治区重大科技专项项目（No.2022A03019）
作者单位 新疆医科大学，新疆名医名方与特色方剂学重点实验室（乌鲁木齐 830054）
通讯作者 安冬青，E-mail：andongqing3@gmail.com
引用信息 白银雪，张夏夏，吴丹丹，等.天香丹抑制P2X7/NLRP3表达改善动脉粥样硬化的作用机制研究［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2024，22（7）：1225-1228.
危险因素之一，As易损斑块的破裂是引发急性心血管事件的主要原因［1］。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症体的激活是影响As易损斑块的重要因素［2］。研究表明，细胞外的腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）可激活嘌呤能配体门控离子通道7（purinergic ligand-gated ion channel 7，P2X7）受体，介导钾外流，导致NLRP3炎症体激活［3-6］，NLRP3炎症体激活后可通过诱发炎症反应参与As的发生与发展［7］。钾离子通道拮抗剂可抑制钾外流，调控炎症小体的激活而改善As，但目前只用于实验研究，临床应用有待进一步的发展，寻找钾离子通道拮抗剂迫在眉睫。As属于中医学“胸痹”“心痛”“真心痛”等疾病范畴。基本病机为本虚标实，治当以通补开泄为法。天香丹是依据通补开泄法理论治疗胸痹的经验方。前期研究表明，天香丹可通过调控核转录因子-κB（NF-κB）信号通路，下调白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性因子水平，控制炎症反应，稳定易损斑块，有效改善As［8-9］。本研究建立As小鼠模型，使用天香丹进行干预，探究天香丹对P2X7/NLRP3通路及相关炎性因子的影响，为中医药治疗As提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物
8周龄无特定病原体（SPF）级雄性载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠30只，从北京维通利华公司购入；普通C57BL/6J小鼠10只，从新疆医科大学动物实验中心购入；体质量（18.00±2.00）g，共同饲养于新疆医科大学动物实验中心屏障环境中。
1.2 实验分组及给药
30只SPF级雄性 ApoE-/-小鼠，10只 C57BL/6 小鼠共同在屏障环境中适应性喂养1周。C57BL/6 小鼠以普通饲料喂养，作为空白对照组；ApoE-/-小鼠给予高脂饮食（基础饲料＋21%猪油＋0.15%胆固醇），喂养12 周建立As模型；将 ApoE-/-小鼠
按照随机数字表法分为模型组（蒸馏水）、阿托伐他汀组［3 mg/（kg·d）］与天香丹组［2.73g/（kg·d）］，每组 10 只。药物剂量［g/（kg·d）］＝9.1×成人临床常药量［g/（kg·d）］。灌胃体积＝0.2 mL/10 g。每日定时灌胃 1 次，连续灌胃 8 周，根据体质量调整用药剂量。所有小鼠自由饮水、饮食，不限制活动。
1.3 药物与试剂
基础饲料和高脂饲料（21.00%脂肪、0.15%胆固醇、78.85%基础饲料）购于北京科澳协力饲料有限公司，生产许可证号为SCXK（京）2020-0010；天香丹颗粒（每包9 g，批号：210540，新齐康药业股份有限公司生产）；阿托伐他汀钙片（20 mg，28片，批号：EE0898，辉瑞制药有限公司生产）；小鼠腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（货号YX-012016M）、小鼠IL-18ELISA试剂盒（货号YX-E21218）、小鼠IL-1β ELISA试剂盒（货号YX-E28912）由上海优选生物科技有限公司生产；免二步法试剂盒（货号PV-6001）、封闭用羊血清（货号ZLI-9022）由中杉金桥公司生产；DBA显色试剂盒（货号ab64238）、P2X7 抗体（货号AB259942）由Abcam公司生产；NLRP3抗体（货号DF7438）由Affinity生物科学有限公司生产。
1.4 仪器
高速离心机（德国Sigma公司生产，型号：Sigma3-18KS）；酶标仪（美国赛默飞公司生产，型号：MULTISKANGO）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司生产，型号：DZF-6090）。
1.5 ELISA法检测血清IL-18、IL-1β、ATP水平
采集每组6只小鼠血清，离心后取上清，根据ELISA试剂盒说明书进行操作，于波长450 nm处分别测定各孔的吸光度值。获得的光密度（OD）值用Origin2021软件进行分析。
1.6 免疫组化检测组织中P2X7、NLRP3表达
每组取6只小鼠腹主动脉石蜡切片，脱蜡和水化后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，每次5 min；柠檬酸钠修复20 min，冷却至室温；PBS洗3次，每次2 min；擦干组织周围液体，在组织上滴加过氧化氢溶液（H2O2），避光放置15 min，以灭活内源性过氧化物酶；PBS洗3次，每次2 min；随后滴加山羊血清置于37 ℃孵育箱内30 min；甩净封闭液，滴加稀释的一抗，4 ℃过夜；取出放置室温，PBS洗3次，每次2 min；甩净PBS后滴加二抗置于37 ℃孵育箱内20 min；PBS洗5次，每次2 min；擦干组织周围液体滴加DBA显色液，自来水冲洗；苏木素复染，水化和透明后，中性树胶封片。在显微镜下随机选取5个视野，采用Image pro plus软件进行分析。
1.7 统计学处理
采用SPSS 27.0统计软件进行统计分析。数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，多样本均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组血清ATP水平比较
与空白对照组比较，模型组ATP水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阿托伐他汀组、天香丹组ATP水平明显降低（P＜0.05）。详见表1。
2.2 各组P2X7、NLRP3表达水平比较
与空白对照组比较，模型组P2X7、NLRP3表达均明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阿托伐他汀组、天香丹组P2X7、NLRP3表达均明显降低（P＜0.05）。详见图1、表2。
2.3 各组血清IL-18、IL-1β水平比较
与空白对照组相比，模型组IL-18、IL-1β水平明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，阿托伐他汀组、天香丹组IL-18、IL-1β水平明显降低（P＜0.05）。详见表3。
3 讨 论
As是一种发生于血管壁的慢性炎症性病理变化，以脂质沉积和免疫细胞浸润为特征［10］，As引发的冠心病、心肌梗死、脑卒中等心脑血管疾病是我国首位致死性疾病，严重危害广大人民群众的身体健康和生命安全［10-11］。钾作为重要的电解质之一，在维持细胞正常代谢与酸碱平衡、细胞膜的应激性和心肌的正常功能中发挥重要作用。钾通道ATP主要分布于心肌和血管平滑肌细胞内膜上［12］。研究表明，P2X7受体是广泛表达于各种免疫细胞中的ATP门控阳离子选择性通道，升高的细胞外ATP激活P2X7受体［3-6］。研究显示，钾离子的相关蛋白P2X7受体在人颈动脉斑块与冠状动脉狭窄中的表达显着增加［13-14］。
NLRP3炎症小体是脂质驱动血管炎症反应的关键因素，在As的发生和发展中起着根本性的作用［15］。细胞内离子稳态的紊乱是NLRP3炎症小体激活的重要细胞应激信号。钾外流被认为在NLRP3炎症小体激活中具有重要作用，几种NLRP3激活剂可降低细胞内钾浓度；相比之下，增加细胞外钾浓度可抑制所有受试NLRP3激活剂的炎症小体激活［16-17］。NLRP3炎症小体被激活后，能够促进产生大量炎性因子IL-1β和IL-18，造成易损斑块破裂，加重As的发展进程［18］。因此，调节钾稳态抑制NLRP3的激活对As的发生、发展极其重要。
中医将As大致归于“胸痹”“心痛”“心痹”“卒心痛”等范畴，
As的基本病机为本虚标实，因虚致实，因实益虚。心气损伤，统血无能，以致瘀血内生；气虚及阳，阳虚则寒或阳虚饮停，以气滞、血瘀、痰浊、寒凝相兼为患。天香丹具有益气活血、辛通开泄的功效，方中君药红景天补气养血，活血化瘀；臣药丹参益气活血、通经止痛，降香化瘀止血、理气止痛，新塔花宁心安神、疏风散热；四药合用益气活血、补虚通络。
本研究发现As模型组小鼠血清ATP含量明显升高，证实As发生时，细胞中钾离子紊乱，引发炎症反应，增加血管中脂质沉积，促进As的发生发展。与模型组相比，天香丹组P2X7、NLRP3蛋白的表达均明显降低，血清炎性因子IL-18、IL-1β水平降低，表明天香丹可以调节钾紊乱，减少炎症发生，减轻脂质沉积，进而改善As的状况。
综上所述，天香丹改善As可能与调节钾稳态而抑制炎症小体的激活有关。
参考文献：
［1］ KOJIMA K，KIMURA S，HAYASAKA K，et al.Aortic plaque distribution，and association between aortic plaque and atherosclerotic risk factors：an aortic angioscopy study［J］.Journal of Atherosclerosis and Thrombosis，2019，26（11）：997-1006.
［2］ NILSSON J.Atherosclerotic plaque vulnerability in the statin era［J］.European Heart Journal，2017，38（21）：1638-1644.
［3］ DI VIRGILIO F，BEN D D，SARTI A C，et al.The P2X7 receptor in infection and inflammation［J］.Immunity，2017，47（1）：15-31.
［4］ GOMBAULT A，BARON L，COUILLIN I.ATP release and purinergic signaling in NLRP3 inflammasome activation［J］.Frontiers in Immunology，2012，3：414.
［5］ KARMAKAR M，KATSNELSON M A，DUBYAK G R，et al.Neutrophil P2X7 receptors mediate NLRP3 inflammasome-dependent IL-1β secretion in response to ATP［J］.Nature Communications，2016，7：10555.
［6］ PERREGAUX D，GABEL C A.Interleukin-1 beta maturation and release in response to ATP and nigericin.Evidence that potassium depletion mediated by these agents is a necessary and common feature of their activity［J］.The Journal of Biological Chemistry，1994，269（21）：15195-15203.
［7］ 葛其卉.从Nrf2/Trx1/TXNIP通路研究活血解毒法调节动脉粥样硬化小鼠炎症体活化介导炎症的机制［D］.天津：天津中医药大学，2021.
［8］ 马文慧，安冬青.天香丹对动脉粥样硬化秽浊痰阻证ApoE-/-小鼠的实验研究［J］.中国中医急症，2015，24（3）：377-379;383.
［9］ SUN L F，AN D Q，NIYAZI G L，et al.Effects of Tianxiangdan Granule treatment on atherosclerosis via NF-κB and p38 MAPK signaling pathways［J］.Molecular Medicine Reports，2018，17（1）：1642-1650.
［10］ POLLER W C，NAHRENDORF M，SWIRSKI F K.Hematopoiesis and cardiovascular disease［J］.Circulation Research，2020，126（8）：1061-1085.
［11］ 祝昀辉，周晓菲，余路阳.蛋白翻译后SUMO化修饰在动脉粥样硬化中的作用与机制［J］.上海大学学报（自然科学版），2019，25（3）：406-414.
［12］ 孙朝阳，周坤，马翔.线粒体ATP敏感性钾离子通道开放剂改善冠心病大鼠模型心肌氧化应激损伤的分子机制［J］.中华老年多器官疾病杂志，2019，18（2）：136-140.
［13］ PISCOPIELLO M，SESSA M，ANZALONE N，et al.P2X7 receptor is expressed in human vessels and might play a role in atherosclerosis［J］.International Journal of Cardiology，2013，168（3）：2863-2866.
［14］ SHI X X，ZHENG K C，SHAN P R，et al.Elevated circulating level of P2X7 receptor is related to severity of coronary artery stenosis and prognosis of acute myocardial infarction［J］.Cardiology Journal，2021，28（3）：453-459.
［15］ DUEWELL P，KONO H，RAYNER K J，et al.NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals［J］.Nature，2010，464（7293）：1357-1361.
［16］ MUOZ-PLANILLO R，KUFFA P，MARTNEZ-COLN G，et al.K＋ efflux is the common trigger of NLRP3 inflammasome activation by bacterial toxins and particulate matter［J］.Immunity，2013，38（6）：1142-1153.
［17］ PTRILLI V，PAPIN S，DOSTERT C，et al.Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration［J］.Cell Death and Differentiation，2007，14（9）：1583-1589.
［18］ NIYONZIMA N，BAKKE S S，GREGERSEN I，et al.Cholesterol crystals use complement to increase NLRP3 signaling pathways in coronary and carotid atherosclerosis［J］.EBioMedicine，2020，60：102985.
（收稿日期：2023-08-30）
（本文编辑王丽）
