鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

万春和，刘荣昌，程龙飞，傅光华，施少华，陈红梅，傅秋玲，黄 瑜

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省禽病防治重点实验室，福州 350013)

鸭病毒性肠炎(duck virus enteritis, DVE)又称鸭瘟(duck plague, DP)，是由鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)引起的常见于鸭、鹅及其他雁形目禽类的一种急性、高度接触性传染病[1]。国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)2011年基于DEV相关研究将其命名为Anatid alphaherpesvirus 1(鸭疱疹病毒1型)。根据ICTV的分类方法，鸭疱疹病毒1型属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesviridae)、马立克病毒属(Mardivirus)[2]。

疱疹病毒基因组庞大，复制非必需区多，可容纳多个外源基因的插入，具有良好的开发基因工程活载体多联疫苗前景，已见有马立克病毒(Marek’s disease virus，MDV)[3]、火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey，HVT)[4]、伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)[5]及传染性喉气管炎病毒(avian infectious laryngotracheitis virus，ILTV)[6]作为基因工程活载体疫苗的相关研究报道。免疫鸭瘟弱毒疫苗是控制鸭瘟的有效措施，该疫苗株是将DEV鸭胚适应株在鸡胚连续传60余代选育而成[7]。DEV弱毒疫苗在我国用于防控DEV超过50余年，该疫苗生产技术成熟、安全无副作用、诱导抗体产生快、免疫保护效果好。此外，DEV弱毒疫苗具有良好的鸡胚适应性，便于后续疫苗标准化生产，已成为水禽疫病活载体疫苗研究开发热点[8-9]。基于DEV弱毒疫苗株作为活载体来开发针对H5N1亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)血凝素基因(HA)的活载体疫苗(rDEV-H5HA)可抵抗H5AIV和DEV强毒攻击[10]；针对禽坦布苏病毒(avian Tembusu virus，ATmV)E蛋白和PrM蛋白的活载体疫苗(rDEV-PrM/TE)可抵抗ATmV和DEV强毒攻击[11]；针对鸭甲肝病毒1型和3型(DHAV-1和DHAV-3)结构蛋白VP1的活载体疫苗(rDEV-2VP1)接种可迅速激发机体体液免疫和细胞免疫，3 d 后可完全抵抗DHAV-1、DHAV-3和DEV强毒攻击[12]，在多联禽用(尤其是水禽)活疫苗研发方面应用前景广阔。

DEV的鉴定有病毒分离、血清中和试验(SN)、琼脂糖凝胶扩散试验(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、微量固相放射免疫吸附试验(Micro-SPRIA)和反向间接血凝试验(RPHA)等经典病毒学方法。随着对DEV基因序列不断研究深入，针对DEV多个基因序列特征的PCR方法、LAMP方法[13]、实时荧光定量PCR方法均见有相关研究报道[14]。随着DEV作为基因工程载体开发疫苗研究不断深入[15]，亟待一种仅针对DEV疫苗株的特异性检测方法用于DEV活载体疫苗免疫机制评估相关研究。本研究基于DEV疫苗株UL2基因特征，设计特异性引物，建立了仅检测DEV疫苗株EvaGreen的实时荧光定量PCR方法，现简要报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit(货号ER201)、细菌基因组提取试剂盒EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(货号EE161)、PCR扩增试剂盒2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)(货号AS122)和T克隆载体试剂盒pEASY-T1 Simple Cloning Kit(货号CT111)均购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒(货号Gel Extraction Kit D2500)和质粒小量提取试剂盒I(货号Plasmid Mini Kit I D6943)均购自Omega Bio-Tek公司；实时荧光定量试剂盒SsoFastTMEvaGreen(货号172-5202)购自伯乐(Bio-Rad)生命医学产品(上海)有限公司；荧光定量八排管(PCR-0208-C)购自爱思进(Axygen)公司；其他常规化学试剂、耗材均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 试验毒株和菌株

鸭肠炎病毒强毒(wild duck enteritis virus，wDEV)、番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus，MDPV)、鹅细小病毒(goose parvovirus，GPV)、新型基因重组型鸭细小病毒(novel recombinant duck parvovirus, N-MDPV)、鸭腺病毒A型(duck adenovirus A，DAdV-A)、鸭源大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)、鸭疫里默菌(Rimerellaanatipstifer，R.A.)和禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，P.M.)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定并保存。

鸭源鹅多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus，GHPV)、鸭圆环病毒(duck circovirus, DuCV)阳性核酸DNA由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定并保存。

DEV疫苗株(vaccine strain duck enteritis virus，vDEV)购自青岛易邦生物工程有限公司，疫苗毒株为DEV鸡胚化弱毒株(CVCC AV1222)，批号为160051201，生产日期：20161020。

1.3 UL2基因克隆与序列分析

1.3.1UL2基因分析比较 下载美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库(GenBank)中DEV的UL2基因组序列(见表1)，利用DNAStar软件对UL2基因进行序列分析，明确DEV强毒和疫苗株UL2基因差异。

1.3.2UL2基因全长的扩增 利用引物设计软件Oligo (v7.37)，设计跨过UL2基因编码区的引物对其进行扩增，引物序列如下，DEV-UL2F：5′-GATTTCTGGGTTTTTGCTGGAC-3′，DEV-UL2R：5′-TGCAATCACGTTGCGTTGTACT-3′，该引物(DEV-UL2F/DEV-UL2R)对DEV疫苗株的预期扩增片段大小为783 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.3 PCR扩增和克隆 利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鸭瘟病毒鸡胚化弱毒株(CVCC AV1222)核酸DNA，使用“1.3.2”设计的UL2基因特异性引物(DEV-UL2F/DEV-UL2R)对其进行PCR扩增。按照2×TransTaq-T PCR SuperMix说明书进行PCR扩增，反应体系(50 μL)参考试剂盒说明书配制，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix 25 μL、上/下游引物(DEV-UL2F/DEV-UL2R，20 μmol·L-1)各1 μL、提取核酸DNA 1 μL，补充灭菌去离子水(22 μL)至终体积50 μL。混匀后瞬时离心后进行PCR反应，反应条件为94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 50 s、56 ℃ 35 s、72 ℃ 85 s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸 10 min。用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用胶回收试剂盒对PCR扩增的目的片段进行切胶回收后克隆到pEASY-T1 Simple Cloning Kit载体上，筛选出阳性重组质粒送由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。将测序结果在NCBI上进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析验证，将符合预期的阳性重组质粒(T-vDEV)经线性化酶切后，作为本研究的阳性标准品。利用微量核酸测定仪测定其浓度后，换算成拷贝数，进行10倍连续稀释后备用。

表1DEV不同毒力UL2基因序列信息

Table1InformationoftheUL2geneofduckenteritisviruswithdifferentvirulence

毒株StrainsGenBank号GenBank No.长度/bpLength毒力Virulence地区Area参考文献ReferenceC-KCEKF263690474VaccineChinaNot availableKKF263690474VaccineChinaYang等(2014、2015)[9, 16]Attenuated strain 2JQ347518474VaccineChinaNot availableChinese commercial DEV vaccineEF449516474VaccineChinaLi等(2009)[17]Attenuated strain 1JQ347517474VaccineChinaNot availableVACEU082088477VaccineChinaLi等(2009)[17]Yulin/2016/60DKX9254401 002VirulentChinaNot availableYulin/2016/30DKX9254391 002VirulentChinaNot availableCVKJ5496631 002VirulentChinaYang等(2014、2015)[9,16]CHvJQ6475091 002VirulentChinaWu等(2015)[18]2085JF9999651 002VirulentGermanyWang等(2011)[19]N1JQ0432161 002VirulentChinaNot availableN2JQ2485961 002VirulentChinaNot availableN3JQ2485971 002VirulentChinaNot availableLSJQ2485981 002VirulentChinaNot availableLH2011KC4802621 002VirulentChinaNot available

1.4 EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.4.1 引物设计与合成 根据“1.3.1”中分析的DEV强毒和疫苗株UL2基因特点，利用Oligo(v7.37) 设计特异性的EvaGreen实时荧光定量PCR的引物，引物序列如下，DEV-EvaF：5′-CAGATTTGACTATTTTTGACCAAC-3′，DEV-EvaR：5′-TAGGCTCCCGTCTCCGTCCCA-3′，预期片段大小为101 bp。

1.4.2 反应条件优化 以含有DEV疫苗株UL2基因阳性重组质粒(质粒浓度为5.25×106拷贝·μL-1)为模板，按照荧光定量试剂盒SsoFastTMEvaGreen试剂盒说明书配制20 μL的实时荧光定量PCR反应体系，在不同引物终浓度(200、300、400、500和600 nmol·L-1)对退火/延伸温度(56、58、60、62和64 ℃)进行优化，循环结束后，制作对应的熔解曲线，确定建立的实时荧光定量PCR方法的最优反应条件。

1.4.3 标准曲线的建立 分别以不同质粒含量(5.25×106～5.25×101拷贝·μL-1，共6个稀释度)作为实时荧光PCR反应的标准品质粒模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导计算出实时荧光PCR反应的标准线性回归方程(标准曲线)。

1.4.4 特异性试验 用优化后最优实时荧光PCR反应条件分别对其他常见鸭源病原(核酸类型为DNA)(如wDEV、MDPV、DuCV、GPV、N-MDPV、DVE、DAdV-A、GHPV、E.coli、R.A.和P.M.)进行实时荧光定量PCR检测，评价建立方法的特异性。用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取相应病毒株(wDEV、MDPV、DuCV、GPV、N-MDPV、DVE、DAdV-A和GHPV)核酸DNA、用细菌基因组提取试剂盒提取相应病菌株(E.coli、R.A.和P.M.)基因组DNA。

1.4.5 敏感性试验 分别连续倍比稀释质粒(含量为5.25×104～5.25×100拷贝·μL-1，共5个稀释度)标准品质粒作为EvaGreen实时荧光PCR反应的模板，用优化后最优实时荧光PCR反应条件进行检测，确定建立的实时荧光定量方法的最小检测限。同时进行常规PCR反应，评价两者的灵敏性。

1.4.6 重复性试验 用优化后最优实时荧光PCR反应条件分别对标准品质粒(含量为5.25×106～5.25×101拷贝·μL-1，共6个稀释度)分别进行检测，每种标准品含量重复3次，计算组内(intra-group)变异系数。分别将上述标准品分装后置于-20 ℃保存，每隔7 d取出，共检测3次，计算组间(inter-group)变异系数。

1.5 临床应用

对10 d番鸭(5只)每只腿肌免疫注射0.25 mL(含1羽份)鸭瘟活疫苗(购自青岛易邦生物工程有限公司)，5 d后采集其肝和食道黏膜刮取物，按常规方法研磨处理后，用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取核酸DNA后，用优化后最优实时荧光PCR反应条件进行检测。每个样品重复检测3次。

2 结 果

2.1 UL2基因特征

2.1.1UL2基因比较 经分析比对，DEV强毒株UL2基因长度均为1 002 bp，编码333个氨基酸；而DEV疫苗株UL2基因长度均为474 bp(除VAC株外，其长度为477 bp)，编码157个氨基酸。经分析发现，DEV疫苗株和强毒株相比存在一个528 bp缺失。DEV疫苗株在DEV强毒株第196—723位核苷酸缺失(见图1)，即连续缺失176个氨基酸，缺失的氨基酸序列如下：GFVACMREGGGIAQQPQTSNSSGRGEVAPSWFNSPTEWEKLSGDYCIGDAWRE- VLYQELQSEVGSRVLLEYERRCDIEEVLPPKN-EIFTWTRYCAPSDVKVIIVGQDPYHQPGQAH-GLAFSVRRGIQIPPSLRNILSAVRRSYPETKIVD-HGCLEAWAKAGVLLLNTTLTVRKGHP。

图1 DEV 强毒株和疫苗株UL2基因差异模式图Fig.1 The schematic organization for UL2 gene of DEV virulent and vaccine strain

2.1.2UL2基因核苷酸相似性比较 分析10株DEV强毒UL2基因，其核苷酸序列完全一致，核苷酸相似性为100%；对DEV疫苗株(除VAC株外，其长度为477 bp)分析发现，其核苷酸相似性在99.8%以上，仅attenuated strain 1株在第4位存在1个核苷酸差异。

2.2 优化后的EvaGreen实时荧光定量PCR条件

优化后的EvaGreen实时荧光定量PCR方法最佳反应体系(20 μL)如下：EvaGreen Mix 10 μL、上/下游引物(终浓度为300 nmol·L-1)0.2 μL、模板2 μL，补充灭菌去离子水至终体积20 μL。优化出的实时荧光定量PCR方法最佳反应条件： 98 ℃预变性2 min；95 ℃ 10 s，62 ℃退火/延伸20 s，40个循环。循环结束后，制作对应的熔解曲线。

2.3 EvaGreen实时荧光定量PCR标准曲线的建立

从不同浓度标准品扩增动力学曲线可见，建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法在5.25×101～ 5.25×106拷贝·μL-1反应范围内有良好的线性关系，相关系数为0.999，扩增效率为100%。以每个浓度标准品模板中拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以出现的循环数阈值(Ct值)结果为纵坐标，获得基于EvaGreen检测DEV实时荧光定量PCR方法的标准曲线(见图2)的Y轴截距为34.95，斜率为-3.218，表明建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。

2.4 实时荧光定量PCR的特异性分析

从扩增曲线(图3a)可见，优化后的EvaGreen实时荧光定量PCR方法仅对DEV疫苗株检测出现阳性扩增，对其他常见鸭源病原(如wDEV、MDPV、DuCV、GPV、N-MDPV、DVE、DAdV-A、GHPV、E.coli、R.A.和P.M.)均未见阳性荧光信号扩增。

从熔解曲线分析(见图3b)可见，建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法仅对vDEV检测在Tm=(90.62±0.28)℃出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物。对其他常见鸭源病原(如wDEV、MDPV、DuCV、GPV、N-MDPV、DVE、DAdV-A、GHPV、E.coli、R.A.和P.M.)均未见特异性峰值，表明建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法特异性强。

图2 实时荧光定量PCR方法的标准曲线Fig.2 The standard curve for the real-time PCR of duck enteritis virus vaccine strain

a.扩增曲线；b.熔解曲线；1. vDEV；2. 对照病原: wDEV、MDPV、DuCV、GPV、N-MDPV、DVE、DAdV-A、GHPV、E. coli、R.A.和P.M.，因没有扩增信号，无法区分具体条带线a. Amplification curve; b. Melting curve; 1. vDEV；2. Control pathogens: wDEV,MDPV,DuCV,GPV,N-MDPV,DVE,DAdV-A,GHPV,E. coli,R.A.和P.M. (Because there is no amplification signal, the experimental control cannot distinguish the specific stripe line)图3 实时荧光定量PCR的特异性分析Fig.3 Specific analysis of real-time fluorescent quantitative PCR

2.5 实时荧光定量PCR的灵敏性试验

用建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法对不同浓度质粒进行检测，结果显示(见图4)其最低检测限为5.25×101拷贝·μL-1(图4a)，常规PCR检测限为5.25×103拷贝·μL-1(图4b)，表明建立的实时荧光定量PCR方法较常规PCR方法更敏感。

2.6 实时荧光定量PCR的重复性

将不同稀释度的标准品分别进行组内和组间的重复性试验，结果显示(表2)组内变异系数为0.55%～1.72%，组间变异系数0.92%～2.49%，Ct值变异系数均在2.5%以内，表明本研究建立的实时定量PCR方法重复性好。

a. 实时荧光定量PCR方法；b.常规PCR；1～5. 5.25×104～5.25×100 copies·μL-1 vDEV质粒; M. 相对分子质量标准a. Real-time fluorescent quantitative PCR; b. Conventional PCR; 1-5. vDEV plasmids with the concentration of 5.25×104 to 5.25×100 copies·μL-1; M. DNA marker图4 实时荧光定量PCR方法的敏感性分析Fig.4 Sensitivity analysis of the real-time fluorescent quantitative PCR

表2EvaGreen实时荧光定量PCR的组内和组间变异系数

Table2Reproducibilitytestofintra-andinter-assayfortheEvaGreenreal-timePCR

标准拷贝数Standard copy number组内Intra-group组间Inter-group循环数Ct方差SD变异系数/% CV循环数Ct方差SD变异系数/% CV5.25×10615.190.100.6615.230.140.925.25×10519.080.110.5519.130.180.925.25×10423.360.170.7323.600.261.115.25×10326.670.230.8726.840.371.375.25×10230.430.371.2030.620.531.735.25×10134.050.591.7234.210.852.49

2.7 临床样品的检测

分别采集免疫5 d后番鸭的肝和食道黏膜刮取物，按常规方法处理后，提取其核酸，用优化的条件进行实时荧光定量PCR检测，每个样品检测三次。结果经计算表明，5只番鸭肝和食道黏膜均检测到阳性扩增信号，番鸭肝中DEV疫苗株平均含量为7.32×105拷贝·μL-1，食道黏膜中平均含量为9.32 ×105拷贝·μL-1。

3 讨 论

随着高通量技术的发展，已见有多株DEV基因组序列研究报道，通过分析比较DEV强毒株和疫苗株基因特征，为寻找DEV鉴别诊断方法提供参考。DEV 的UL2 是单纯疱疹病毒 1 型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)的UL2同源基因，后者编码尿嘧啶 DNA 糖基化酶(uracil-DNA glycosylase，UDG)，是一个非必需基因，在DNA复制过程中可将dUTP错误插入或是胞嘧啶的脱氨基造成的尿嘧啶残基切除，保证DNA复制的正确性和顺利进行[20-21]。从UL2基因特征来看，DEV疫苗株UL2基因均为474 bp(除VAC株外)，核苷酸序列十分保守；而强毒株UL2基因全长均为1 002 bp，核苷酸序列完全一致，但尚未见研究证实该缺失和DEV毒力差异相关。但基于该特征性差异，已建立DEV强毒株和疫苗株的鉴别诊断方法[22-23]。

实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常用的荧光物质有荧光探针和荧光染料。荧光染料主要有不饱和荧光染料(主要是SYBR GreenⅠ)和饱和荧光染料(主要是EvaGreen)两类。EvaGreen和SYBR GreenⅠ具有相似的光谱特性，但是EvaGreen对PCR的抑制性远小于SYBR Green Ⅰ，比传统DNA聚合酶具有更快的速度和更短的反应时间，而不会影响实时荧光定量PCR的灵敏度、效率和重复性，可极大地降低反应时间[24-25]。

当前，建立检测DEV核酸的实时荧光定量PCR检测方法，无法科学有效地区分DEV强毒株和疫苗株。本研究通过对GenBank数据库中DEV强毒株和疫苗株UL2基因序列进行分析比较，明确DEV强毒株和疫苗株UL2基因存在特异性核苷酸差异，并基于该差异设计特异性的实时荧光定量PCR引物，经条件优化后建立基于EvaGreen饱和荧光染料的仅特异性检测DEV疫苗株的实时荧光定量PCR方法。该方法特异性强，仅对DEV疫苗株检测出现阳性荧光信号，对其他鸭群常见传染病病原均无交叉反应；灵敏度高，最低检测限仅为52.5拷贝 ·μL-1；重复性好，组内重复试验和组间重复试验的变异系数均较低(最高仅为1.72%和2.49%)。本研究建立的特异性检测DEV疫苗株的实时荧光定量PCR方法，为后续开展DEV致弱机制和DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制研究提供参考。

4 结 论

基于DEV强毒和活疫苗株UL2基因差异，建立了特异性强、敏感性高、重复性好的EvaGreen检测DEV疫苗株的实时荧光定量PCR方法。