基于UPLC-Q-TOF-MS/MS代谢组学研究土霉素和穿心莲内酯对鸡代谢的影响

王芮杰,洪志楷,董英娇,陈 瑶,王晋宇,王冠华*

(1.华南农业大学兽医学院,广州 510642;2.广东广垦畜牧工程研究院有限公司,广州 510612)

鸡的代谢受多种因素的影响,包括品种差异、饮食结构以及各种环境应激等,这些影响因素体现在各个器官和组织的代谢过程中,如叶酸可能影响鸡肝细胞脂肪代谢[1]。除此之外,一些药物对鸡的代谢有显着的影响,Хomehko和谢敏康[2]发现在呋喃唑酮的影响下游离氨基酸生理学比例会失调,从而影响鸡的代谢。肠道是鸡营养转化和吸收的重要场所,肠道菌群参与调节宿主的多种代谢途径,健康的肠道菌群是维持机体免疫系统和肠道内环境平衡的一个关键因素,而肠道内环境的平衡对发挥疫苗的最佳性能,提高机体对病原微生物的免疫力至关重要[3]。鸡肠道菌群失调是指肠道各菌群之间及各菌群与机体间相互依存、相互制约的动态平衡被打破,会引发出一定的临床症状,如肠毒综合症、坏死性肠炎、球虫等多种与肠道有关的疾病[4]。

在养殖过程中,人们通常会使用抗生素、益生菌制剂以及一些中药来预防或治疗禽类疾病,其中,土霉素(oxytetracycline,OTC)是一种广谱抑菌素,价格低廉,在畜牧上广泛应用于鸡白痢、伤寒、禽霍乱等传染病的防治[5],但是抗生素滥用会造成雏鸡胃肠道损伤,抑制生长[6],因此临床当中开始选择用中药治疗。穿心莲内酯(andrographolide,AG)是二萜类内酯化合物,AG作为传统中草药穿心莲的主要有效成分,因其无明显的毒副作用而在临床上广泛使用。它对雏鸡胃肠道疾病具有较好的治疗效果,价格低廉,能够大规模用于养鸡场,有研究发现穿心莲内酯在提高机体抵抗力、抗病毒和清热解毒等方面有较好的效果[7]。代谢组学是一种研究范围较全面、动态且连续的研究方式,通过系统地研究维持机体稳态并参与其新陈代谢的所有内源性小分子代谢产物,分析机体的整体代谢状况[8]。近年来,人们对肠道菌群的研究较多,由于肠道微生物的代谢过程与宿主的新陈代谢存在相通与互补的情况,菌群与宿主间也存在着积极的交换代谢及“共代谢”过程。因此,为了进一步了解肠道微生物在机体健康与疾病发生发展中承担的作用,理解肠道微生物和宿主之间的互利共生关系是十分有必要的[9]。

代谢组学通过与元基因组学、微生态学及多维统计的分析方法综合利用,深入地研究肠道微生物与其宿主间的相互作用,成为揭示肠道菌与机体健康和疾病关系的突破口[10]。为了研究土霉素和穿心莲内酯对鸡肠道代谢的影响以及调控代谢的差异性,本文以仔鸡为模型,用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)采用非靶向代谢组学方法对穿心莲内酯和土霉素干预后的排泄代谢物进行研究,分别对两种药物干预后的差异性代谢物进行筛选鉴定并探讨可能受其影响的代谢途径,为临床应用穿心莲内酯和土霉素对鸡代谢的干预机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

于广州市晋邦禽业有限公司购入30只黄羽肉鸡,2周龄,体重(250±20)g;饲养条件:温度23～25 ℃,湿度(45%±5%),光照12 h,自由饮水。

1.2 主要试剂和仪器

药品与试剂:穿心莲内酯(98%)、土霉素(97%)、L-2-氯苯丙氨酸(97%)均购自上海阿拉丁公司;甲醇(质谱级)、乙腈(质谱级)均购自美国Fisher公司;甲酸(质谱级,美国Waters公司);甲醇(分析级,广州化学试剂公司);蒸馏水(广州屈臣氏公司)。

主要仪器与设备:XEVO G2-XS Q-TOF 超高效液相色谱-高分辨串联质谱联用仪(美国,Waters公司);Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm);KH-100SPV型超声波清洗仪(江苏,昆山超声仪器有限公司);5804 R型高速离心机(德国,Eppendorf公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 药物的制备 称取适量药物溶于生理盐水中,超声15 min,配制成浓度为0.2 mmol· L-1的穿心莲内酯和土霉素溶液。

1.3.2 分组及样本采集 将30只2周龄黄羽肉鸡适应性喂养7 d(温度23～25 ℃,相对湿度 45%±5%,12 h光/暗循环,光循环从早上 7∶00 开始),随机分为空白对照组(normal control,NC),穿心莲内酯组(AG),土霉素组(OTC),每组10只,共3组。试验鸡3周龄时,以灌胃方式给药,每次给药前 8 h禁食并称重,空白对照组给予生理盐水,给药组每天给药1次,剂量为1 mL,连续5 d,整个试验期间自由饮食和饮水。末次给药后,禁食禁水12 h,笼下铺设薄膜,并在24 h收集粪便混合物,将所收集排泄物中加入 0.5 mL 10 g·L-1叠氮钠(NaN3)溶液做防腐剂。收集NC组排泄物作为空白对照样。迅速称量并分装,置于-80 ℃ 冰箱冻存备用。

1.3.3 样本前处理 每组称取10份自然解冻的排泄物样本0.1 g,分别标记为NC组,OTC组,AG组;称量后每份加入10 μL L-2-氯苯丙氨酸(300 mg·L-1,甲醇配制)作为内标物,加入700 μL提取液(乙腈、水体积比1∶1混合液),研磨后匀浆涡旋混合1 min,超声提取20 min;样本用Eppendorf-5430 R低温高速离心机在10 000 r·min-1,4 ℃ 条件下离心15 min;取上清液于-80 ℃冻存1 h,重复操作,10 000 r·min-1,4 ℃ 离心15 min,收集上清液分装于-20 ℃ 保存;所有样本经0.22 μm滤膜过滤后吸取上清液至进样小瓶中用于UPLC-Q-TOF-MS/MS测定。同时,从所有已处理样本中取等量上清液混匀,作为质控(QC)样本,上机时每10针的试验样本中插入1针质控样本,以评价系统重复性。

1.3.4 色谱和质谱条件 色谱分离条件:色谱柱使用Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm);柱温设置为40 ℃,进样器温度为4 ℃;流动相A为0.1 mL·L-1甲酸-水,流动相B:0.1 mL· L-1甲酸-乙腈;进样器流速为0.3 mL· min-1;进样量设置为2 μL;梯度洗脱条件:0～7 min,B: 5%～40%;7～11 min,B: 40%～90%;11～12 min,B: 90%～100%;12～13 min,B: 100%;13～13.1 min,B: 100%～5%;13.1～15 min,B: 5%。

质谱检测条件:在电喷雾电离模式(ESI)下进行分析,数据采集采用Centroid(棒状图数据)模式,扫描范围为m/z=50～1 200,毛细管电压设置为3 000 V,脱溶剂温度设置为350 ℃,脱溶剂气体流速为650 L· h-1,离子源温度设置为120 ℃,锥孔气体流量为600 L·h-1。

1.4 数据统计分析

1.4.1 质量评估 根据正负离子的扫描模式,得到所有代谢物的二维数据阵,并对QC样本数据进行相关性分析,如果其决定系数R2值>0.95,则认为达到了质控要求。

1.4.2 数据标准化处理 使用UPLC-Q-TOF-MS/MS进行测试,在MassLynx XS工作站MSE模式下进行数据采集,采集一级、二级质谱数据(保留时间、质荷比、峰面积),之后将数据导入Progenesis QI软件,采用内标(L-2-氯苯丙氨酸)进行归一化处理。

1.4.3 差异性代谢物的筛选及鉴定 利用SIMCA软件对数据文件分别进行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)及双尾Student’sT检验等,以VIP>1,P<0.05为标准筛选出差异代谢物,通过检索HDMB、KEGG数据库进行定性。将差异代谢物进行KEGG 通路注释并用MetaboAnalyst 进行代谢通路富集和分析,以气泡图的形式可视化。再将代谢物按通路分类,整理出某一通路中所有差异代谢物。

2 结 果

2.1 PCA分析

正离子模式下鸡排泄物样本的总离子流图见图1,QC 样品的PCA得分图见图2。如图2A、B所示,QC 样品在正离子模式下相对于负离子模式聚集得更紧密,显示本研究中正离子模式下的采集方法更稳定,更具有重复性。因此下文在对差异代谢物及其通路进行分析时多采用正离子模式下数据分析。如图3所示,正负离子模式下根据排泄物中代谢物的主成分可以将对照组和OTC组明显区分开,两组间代谢物存在显着差异,为下一步研究其差异组分奠定理论基础,然而对照组与AG组间成分区分不十分显着,正离子模式下尤其明显,两组分未区分开。并且,OTC组和AG组的PCA图也可看出同组内不同样本间分布比较分散,聚类不明显。

图1 ESI+模式下鸡排泄物样本的 UPLC-Q-TOF-MS总离子流图Fig.1 UPLC-Q-TOF-MS total ion flow diagram of chicken fecal urine samples in ESI+ mode

图2 3组QC样本PCA得分图Fig.2 PCA scores graphs for three groups of QC samples

A.NC-OTC (ESI+); B.NC-AG (ESI+); C.NC-OTC (ESI-); D.NC-AG (ESI-)图3 ESI+、ESI-模式PCA得分图Fig.3 PCA scores diagrams in ESI+ and ESI- mode

ESI+模式下空白组与AG组样本分布交叉,两组样本区别不显着,可以得出AG组与空白组样本代谢组学研究变化不明显,AG对鸡代谢影响不显着。但OTC组与空白对照组排泄物样本分布距离明显,说明OTC可显着引起鸡代谢的变化。

2.2 OPLS-DA分析

利用SIMCA软件,对NC-OTC组、NC-AG组样本进行OPLS-DA分析,结果见图4。

A.NC-OTC (ESI+); B.NC-AG (ESI+); C.NC-OTC (ESI-); D.NC-AG (ESI-)图4 ESI+、ESI-模式OPLS-DA得分图Fig.4 OPLS-DA scores diagrams in ESI+ and ESI- model

结果表明:NC-OTC组在ESI+模式下,R2Y=0.991,R2X=0.831,Q2=0.974;ESI—模式下,R2Y=0.975,R2X=0.663,Q2=0.958。在正负模式下,NC-OTC组区分相当明显,提示内源性代谢产物存在一定差异,说明土霉素对于鸡肠道菌群的代谢有影响。

NC-AG组在ESI+模式下,R2Y=0.902,R2X=0.931,Q2=0.753;ESI—模式下,R2Y=0.955,R2X=0.478,Q2=0.89。正负模式下,NC-AG组区分明显,但不如OTC组,说明穿心莲内酯对鸡代谢也有一定作用。

OPLS-DA分析结果显示,各样本组间区分明显,所有样本均在95%置信区间内。经过200次置换检验,ESI+模式下,与空白组相比,土霉素组:R2=0.524,Q2=-1.32;穿心莲内酯组:R2=0.401,Q2=-0.794;ESI-模式下,与空白组相比,土霉素组:R2=0.334,Q2=-0.65;穿心莲内酯组:R2=0.494,Q2=-0.422,两组数据的Q2均为负数,说明没有过拟合且模型相对可靠,能够很好地解释组间差异,其模型验证图见图5。NC-OTC组区分明显,提示内源性的代谢产物存在一定差异,说明穿心莲内酯和土霉素对于鸡的肠道代谢均有作用。

A.NC-OTC (ESI+); B.NC-AG (ESI+);C.NC-OTC (ESI-); D. NC-AG (ESI-)图5 ESI+、ESI-模式OPLS-DA模型验证图Fig.5 OPLS-DA model validation diagrams in ESI+ and ESI- model

2.3 差异代谢物的筛选

对各组鸡排泄物中代谢物样本数据进行OPLS-DA分析和t检验,以 “VIP>1、P<0.05”(差异显着)为筛选条件,结合这两种统计方法及阈值来筛选差异代谢物,可以增强数据的可靠性(图6、表1～4)。

表1 NC-OTC组排泄物样本代谢途径分析列表Table 1 List of metabolic pathways analysis on the differential metabolites of fecal and urinary samples in NC-OTC group

A.NC-OTC; B.NC-AG图6 ESI+模式火山图Fig.6 Volcano diagrams in ESI+ model

2.4 差异代谢物的代谢通路分析

利用MetaboAnalyst 在线分析网站对差异代谢物进行代谢通路富集分析和拓扑分析,以拓扑分析的impact值为依据会使结果更加具有可信度,其分析所得差异代谢物层次聚类分析热力图及代谢通路分析图如图7所示。

A.NC-OTC; B.NC-AG图7 ESI+模式下差异代谢物层次聚类分析热力图(A、B)及排泄物代谢通路分析(C、D)Fig.7 Heatmap from hierarchical clustering analysis of differential metabolites (A, B) and fecal and urinary metabolic pathway analysis (C, D) in ESI+ model

结果显示:表1中OTC组与空白组相比,有15条存在差异的代谢通路,以表3中差异代谢物存在的通路为标准,筛选出最相关代谢通路。OTC组存在2条最相关通路,即影响甘油磷脂代谢(glycerophospholipid metabolism)和亚油酸代谢(linoleic acid metabolism)的通路。该结果提示:土霉素可能通过这15条代谢通路对鸡的肠道代谢产生影响。

表2中AG组与空白组相比,有17条存在差异的代谢通路,以表4中差异代谢物存在的通路为标准,筛选出最相关代谢通路。AG组存在5条最相关通路,即影响甘油磷脂的代谢(glycerophospholipid metabolism)、鞘磷脂代谢(sphingolipid metabolism)、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢(cysteine and methionine metabolism)、不饱和脂肪酸的生物合成(biosynthesis of unsaturated fatty acids)以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢(glycine, serine and threonine metabolism)通路。该结果提示:穿心莲内酯可能通过这17条代谢通路对鸡代谢产生影响。其中两组通路分析中有12条共有通路,说明土霉素和穿心莲内酯对鸡的肠道代谢产生的影响途径相似。

表2 NC-AG组排泄物样本代谢途径分析列表Table 2 List of metabolic pathways analysis on the differential metabolites of fecal and urinary samples in NC-AG group

3 讨 论

本试验以非靶向代谢组学技术为基础,以多元和单变量统计分析为数据处理方式,探究等浓度的土霉素和穿心莲内酯给药后对鸡肠道代谢物的影响。为研究差异代谢物在代谢通路中的位置和作用,探究土霉素和穿心莲内酯对鸡的生理功能和代谢的影响,对用药后排泄物中有显着变化的化合物进行分析,并与HMDB、KEGG等线上数据库进行比对。通过对比表1、2发现两组通路分析中有12条共有通路,联系表3、4找出最相关的代谢通路,OTC组为亚油酸代谢和甘油磷脂代谢通路,AG组为甘油磷脂的代谢、鞘磷脂代谢、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢、不饱和脂肪酸的生物合成以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢通路,最后通过分析这些最相关代谢通路的作用,将其划分为磷脂代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢三部分。

表3 NC-OTC组排泄物样本差异代谢物列表Table 3 List of differential metabolites in fecal and urine samples of NC-OTC group

3.1 磷脂代谢

磷脂根据分子结构不同分为甘油磷脂(phosphoglyceride)和鞘氨醇磷脂,本试验结果证明OTC和AG都可以通过这两种物质的代谢影响鸡的生理状况。磷脂被磷脂酶A1或A2水解后生成溶血磷脂(lysophospholipid,LP),比较重要的LP有溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)、溶血磷脂酸和某些鞘磷脂,这些溶血磷脂在用药后鸡的代谢中起重要作用。有研究表明,LP可以激活PPARγ(peroxisome proliferators activated receptor,PPAR),参与血管性痴呆、脊髓损伤和动脉粥样硬化等疾病进程[12],其对此类疾病的参与作用可能是通过被水解为甘油、碱基和磷酸后,参与糖代谢,磷脂再合成等代谢过程实现。LysoPC是一种氧化低密度脂蛋白成分,对肠屏障具有破坏作用,并具有促炎特性[13],LysoPC作为OTC组的重要差异代谢物,OTC对肠道菌群结构及代谢的破坏作用可能与LysoPC这种对肠道屏障的刺激相关。本次经筛选所得差异代谢物LysoPC(18∶1)、LysoPC(18∶2)都是溶血卵磷脂家族中重要的化合物,在多种肝疾病、心血管疾病及脂类代谢紊乱引起的疾病中起重要作用。所有LysoPCs不仅影响磷脂代谢,在动物机体脂肪酸代谢中也发挥关键作用[14-16],多种代谢过程相互影响并相互转化。本研究中,与NC组相比,用药后,药物处理组鸡的上述磷脂水平下降,反映OTC和AG可能通过调节甘油磷脂代谢途径干预鸡代谢。

鞘脂(sphingolipids)是一个在代谢中相互关联的大家族,包括神经酰胺(ceramide,Cer)、鞘磷脂(sphingomyelin, SM)和鞘糖脂等,根据表4 可以看出鞘脂类为AG处理组的重要差异代谢物。鞘氨醇(Sph)属于鞘脂类,鞘脂可以转化为Sph,再被催化生成1-磷酸鞘氨醇(S1P),S1P也属于LP,起调节细胞功能,参与多种信号转导通路的作用。Cer是合成和降解鞘脂的代谢中心,是最简单的鞘脂,也是合成更复杂的鞘脂的通用前体[17]。丝氨酸和软脂酰辅酶A经过一系列酶促反应可以生成Cer,其经神经酰胺酶水解后又可以生成鞘氨醇。由于鞘氨醇的生成依赖于饱和脂肪酸,因此饱和脂肪酸氧化途径减弱或饱和脂肪酸摄入过多都可能引起组织中鞘脂积累,并导致一系列脂类代谢疾病,根据这一代谢过程,研究证明可以通过抑制和控制鞘脂合成酶来治疗动脉粥样硬化、心肌病和糖尿病等脂质代谢异常引起的疾病[18]。LysoPC的磷脂酰胆碱可以通过SM合成酶转移到神经酰胺中[19-20],Cer能够介导内皮细胞凋亡,通过直接损伤血管内皮促进动脉粥样硬化的作用已被证实[18,21],机体内Cer水平与高血压等血管疾病的严重程度成正比,对应AG处理组鞘脂生物标志物Cer上调与LysoPCs下调,提示鞘脂代谢的整体异常。表4中差异代谢物Phytosphingosine即鞘氨醇的上调也证明磷脂代谢在AG对鸡代谢的调控中起重要参与作用。

表4 NC-AG组排泄物样本差异代谢物列表Table 4 List of differential metabolites in fecal and urine samples of NC-AG group

3.2 脂肪酸类代谢

亚油酸(linoleic acid,LA)学名十八碳二烯酸,是一种ω-6多不饱和脂肪酸,亚油酸的代谢是OTC和AG干扰鸡正常代谢的重要途径。LA能被肠道微生物代谢为共轭亚油酸[22],从而改善糖脂代谢[23]。根据多元统计学分析,筛选出一种参与不饱和脂肪酸生物合成的差异代谢物为肾上腺酸(adrenic acid),是由花生四烯酸的2碳链延长形成的天然多不饱和脂肪酸,其在鸡排泄物代谢组中下调可能是AG引起亚油酸脂质过氧化造成。脂质氧化过程中,LA经自由基诱导自动氧化或脂肪氧合酶催化,生成羟基十八碳二烯酸(hydroxyoctadecaenoic acids,HODEs),又名alpha-dimorphecolic acid,参与亚油酸代谢通路,其在表3中的上调趋势可能由于LA的代谢引起。研究表明[24-26],内源性HODEs具有病理生理学意义,脂质代谢过程中产生的tHODE以及9-HODE、13-HODE与LA之间的相互关系可能导致某些疾病的发生发展,将来可能成为诊断某些疾病的新的标志物。9-HODE 是过氧化物酶体增殖剂活化受体 γ(PPARγ)的天然激动剂[27],参与磷脂代谢的LysoPCs也可以激活PPARγ,两者都可以通过激活 PPARγ,调控糖代谢,改变脂肪细胞分化[28],改善脂质代谢。LysoPCs参与的磷脂代谢通路与HODEs参与的脂肪酸类代谢相互影响,共同作用于鸡的代谢。

3.3 氨基酸代谢

氨基酸是生物体的基本物质,氨基酸可以通过进入三羧酸循环(TCA cycle)进行有氧代谢,为机体提供能量,在生物体内发挥重要作用。本次代谢分析所得甘氨酸(Gly),丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr),半胱氨酸-蛋氨酸的代谢通路是根据富集得到最重要的氧化还原和代谢相关的途径。其中,甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸由丙酮酸生成乙酰辅酶A,以乙酰辅酶A途径进入TCA循环,甲硫氨酸(蛋氨酸)则以琥珀酰辅酶A途径进入TCA循环。生化中3-磷酸甘油酸经氧化和转氨作用生成3-磷酸丝氨酸,最后水解形成丝氨酸。分析显示,Gly-Ser-Thr间的相互作用代表了一个主要的代谢交叉点,与几种非常重要的生物路径相关联。Gly-Ser-Thr可以通过丝氨酸羟甲基转移酶和苏氨酸醛缩酶可逆性相互转化,各种氨基酸的转化途径如图8A、B所示。其中,Ser是核苷酸合成的一个碳库的来源,在图8B的蛋氨酸循环中,可以明显看出Ser与蛋氨酸循环直接相关[11]。动物通常以蛋氨酸降解路径合成半胱氨酸,Ser和高半胱氨酸合成胱硫醚后经分解生成α-酮丁酸和半胱氨酸。另外,参与Gly-Ser-Thr代谢的Ser还可以通过合成磷脂酰丝氨酸参与磷脂代谢。丙酮酸是氨基酸代谢途径的重要代谢产物,其在排泄物中含量显着上调可以推断OTC和AG干预后可调节鸡氨基酸代谢。

图8 几种重要的生物学通路[11]Fig.8 Main pathways of lifespan[11]

在实验药物方面:穿心莲内酯具有广泛的药理作用,如抗炎、抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、保肝利胆、保护心血管系统等。穿心莲内酯抗炎活性作用涉及多个炎症有关靶点,可以通过降低炎症介质的合成和释放、调节免疫反应和氧化应激等方式完成。其抗肿瘤的效果可通过调控不同的细胞信号通路,阻滞肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡等方式实现。本研究表明,AG具有一定的调节糖代谢的能力,表现为通过干扰甘油磷脂的代谢、不饱和脂肪酸的生物合成等发挥降糖作用。AG调节糖代谢的作用机制与阻抑炎症反应、降低肠道通透性有关,通过改善肠道微生物群结构,维持脂蛋白密度和脂质代谢的平衡[29]。另外,NC-OTC组结果表明,连续摄入土霉素可对鸡机体正常的代谢功能产生影响,主要表现在通过影响甘油磷脂的代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、亚油酸代谢等引起机体脂肪酸代谢的变化。

4 结 论

以鸡为试验对象,研究等剂量土霉素和穿心莲内酯影响机体代谢的途径,结果表明,两者都能够显着调节动物内源性代谢,其中,共有的12条代谢通路说明土霉素和穿心莲内酯对鸡的肠道代谢影响途径十分相似,作用机制或与调节磷脂代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢等重要内源性代谢通路有关,且土霉素作用较穿心莲内酯显着。同时,本研究经代谢组学分析进一步揭示了穿心莲内酯具有一定的类抗生素效用,为其代谢机制的推理提供参考。