王 贺,郭志廷,李建喜,张景艳,王 磊,张 康,孙继文,尚小粉,马永华*
(1.甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070;2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,农业农村部兽用药物创制重点实验室,甘肃省中兽药工程技术研究中心,兰州 730050)
球虫病是鸡最常见的肠道寄生虫病,对全世界养鸡场造成巨大危害,严重影响鸡场经济效益。柔嫩艾美耳球虫作为致病力和毒性最强的球虫[1-2],重症感染病鸡剖检会发现一侧或两侧盲肠严重肿大,盲肠内充满大量血液或带有肠芯[3-4];柔嫩艾美耳球虫属于宿主特异性的胞内寄生虫,主要寄生在鸡盲肠隐窝上皮细胞[5],可造成盲肠黏膜损伤,上皮细胞肿胀、坏死崩解和脱落[6],从而阻碍肠道对于养分的吸收影响机体的新陈代谢[7],导致血痢、体重减轻,甚至死亡。目前,在饲料中添加抗球虫药物是防治鸡球虫病的主要方法。其中,应用广泛的为一些聚醚类离子载体抗生素和化学合成药物抗球虫饲料添加剂[8],但是耐药性的产生[7],使得这些药物治疗或预防效果降低,且存在药物残留影响食品安全[9]。艾美耳球虫几乎对所有已知的抗球虫药物产生耐药性。由于艾美耳球虫感染可产生较强免疫反应,疫苗接种成为预防球虫病的有效方法之一[7-8],但疫苗可能引发严重的出血性反应或吸收障碍[9-13]。中草药具有耐药风险低、安全、副作用小等优势[14-15],逐渐成为消费者追求的主流产品[16]。研究表明,许多中草药对治疗鸡球虫病有效,如常山、青蒿[17]、槟榔[18]、川楝子[19]、白头翁、肉桂[20]等。目前,市场上存在很多用于控制球虫病中草药复方[21]。有些中药并不是直接作用于球虫,而是作用于肠道,因其具有免疫调节作用、抗氧化或抗炎特性,从而帮助宿主抵抗球虫感染[22-23]。有些中草药提取物可以通过改变卵囊壁形成和抑制孢子形成[24-25],或通过破坏子孢子[26],对球虫产生直接杀灭作用。部分中草药提取物可以提高球虫病后机体的恢复能力[27-28]。
研究表明,中药常山提取物可以有效预防和治疗鸡球虫病,其中的主要成分常山碱在一定程度上能够增强机体的免疫力,刺激机体免疫反应中相关免疫细胞的发育,如参与细胞免疫的淋巴细胞和巨噬细胞,同时也可以抑制球虫在宿主肠道黏膜中的生长发育,从而减轻对宿主寄生部位的破坏和减少球虫卵囊的形成[29]。本试验通过常山散对感染柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的雏鸡生长性能、每克粪便卵囊数(OPG)、盲肠病变评分、抗球虫指数、血清免疫球蛋白及免疫器官指数测定,研究常山散对感染雏鸡抗球虫效果和免疫功能的影响,明确最佳给药时间,为后期常山散防治鸡球虫病提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物
1日龄白羽肉鸡购自酒泉市旺苗禽业养殖场,前期于SPF隔离舱内饲养至12日龄,后转移至严格消杀且无球虫污染的试验动物房,并于14日龄滴鼻接种新-传二联苗,饲养至16日龄。
1.2 球虫卵囊
柔嫩艾美耳球虫由中国农业大学寄生虫病实验室提供。试验开始前,将柔嫩艾美耳球虫卵囊重新进行传代,确保卵囊感染活力。将孢子化率为85%以上的球虫卵囊于2.5%重铬酸钾溶液4 ℃保存备用。
1.3 药品与试剂
常山散中试产品(100 g·袋-1,批号2021111501,1 g本品相当于常山原药材10 g;有效成分是常山生物碱,含量1.5%),石家庄正道动物药业有限公司生产。常山散主要生产工艺:利用超声波提取技术,从中药常山中提取得到常山浸膏,干燥粉碎后,加入适量淀粉混匀即得(常山浸膏和淀粉质量比9∶1)[30];鸡新城疫-传染性支气管炎二联活疫苗(La Sota株+H120株),购自乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂;免疫球蛋白IgG、IgA、IgM检测试剂盒,购自北京索莱宝科技有限公司。
1.4 试验动物分组与给药
试验开始前连续3 d进行粪检,确认雏鸡没有感染球虫。试验分为6大组:攻虫前1天(15日龄)、攻虫当天(16日龄)、第2天(17日龄)、第3天(18日龄)、第4天(19日龄)和第5天(20日龄)给药试验组,每个试验组又分为3个处理组,分别为Ⅰ组(健康对照组)、Ⅱ组(感染性对照组)和Ⅲ组(常山散推荐剂量组,连续给药4 d)。每组10只鸡,共180只,Ⅰ组单独饲养,各试验组开始试验之前均禁食12 h,正常饮水。除Ⅰ组外,其他各组试验鸡均于16日龄按照5×104·只-1剂量人工感染柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊。各试验组鸡分别于19、20、21、22、23和24日龄早上9:00先称重后捕杀,采集鸡盲肠内容物检查球虫卵囊,观察鸡临床症状和盲肠病理变化。具体分组见表1。
1.5 测定指标和方法
1.5.1 生长性能测定 以重复组为单位,试验鸡于试验前后分别称重(称重前均禁食12 h,不禁水),详细记录各组鸡的采食量,计算各组鸡平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)。综合评判常山散对感染柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段雏鸡生长性能的影响。
1.5.2 抗球虫指数测定 抗球虫指数(anticoccidia index,ACI)根据美国默克(Merck)公司计算公式:ACI=(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)。根据ACI值判定其抗球虫效果:120以下为无效;120～160为差;160～180良好;180以上为优秀[31]。
存活率=(各试验组结束雏鸡数量/各试验组开始雏鸡数量)×100%
相对增重率=(各试验处理组的平均增重/健康对照组的平均增重)×100%
试验结束,每组试验鸡分别称量,采血后捕杀,取盲肠组织并打开进行盲肠病变计分。收集各组鸡盲肠内容物,破碎,用饱和食盐水漂浮,纱布过滤2～3次,过滤液静置10 min,盖玻片蘸取滤液表面,用细胞计数板于显微镜下观察并进行卵囊计数。
病变记分参照Johnson和Reid(1970)的病变记分方法,两侧盲肠病变不一致者以严重一侧为准。见表2。
表2 病变记分标准
病变值=各试验组的平均病变记分×10。
将收集的盲肠内容物用血细胞计数板计算每克粪便卵囊数(OPG值),根据卵囊比数换算成卵囊值。卵囊比数=(健康组或药物试验组OPG值/攻虫对照组OPG值)×100%。见表3。
表3 卵囊值与卵囊比数关系
1.5.3 中药常山散对健康雏鸡免疫功能的影响 分别于试验结束日,每组随机抽取6只鸡,称重后心脏采血8～10 mL,室温静置2 h,4 500 r·min-1离心20 min,分离血清。将收集的血清置于-20 ℃保存备用,ELISA 法检测血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM含量。采血完毕后处死,取脾和法氏囊,去除粘连的脂肪及其他组织,用吸水纸吸干表面液体后称重,计算免疫器官指数。
脏器指数=脏器重量(mg)/体质量(g)
1.6 数据统计与分析
2 结 果
2.1 常山散对雏鸡感染球虫不同发育阶段生长性能的影响
由表4可知,攻虫前1天和攻虫当天试验组中Ⅰ组和Ⅲ组的日均增重(ADG)无显着差异(P>0.05),但与Ⅱ组相比差异显着(P<0.05);攻虫后第2、3、4、5天试验组各小组间ADG差异显着(P<0.05),与Ⅰ组相比,Ⅱ组ADG下降明显,Ⅲ组有所改善。随着球虫的不断发育,与Ⅰ组相比,Ⅱ组和Ⅲ组的日均采食量(ADFI)呈现不同程度的下降,其中Ⅱ组ADFI下降较多,Ⅲ组相对较少;攻虫后,Ⅱ、Ⅲ组料重比(F/G)逐渐增加,但与Ⅱ组相比,Ⅲ组的料重比相对较低。
表4 常山散对雏鸡感染球虫不同发育阶段生长性能的影响
2.2 常山散对雏鸡感染不同球虫发育阶段OPG及盲肠病变计分的影响
研究结果表明,除攻虫前1天和攻虫当天试验组无球虫卵囊外,随着球虫的发育,其他试验组的OPG值差异显着(P<0.05),与Ⅱ组相比,Ⅲ组的OPG显着降低(P<0.05);Ⅱ组和Ⅲ组的盲肠病变计分差异显着(P<0.05),由于球虫生长发育过程中对宿主寄生部位盲肠的不断侵害,各试验组中Ⅱ组的盲肠病变计分逐渐上升,Ⅲ组虽也呈上升趋势,但相较于Ⅱ组,病变计分均有所下降。详见表5和图1。
A. 健康对照组;B. 感染对照组(1～6分别为攻虫前1天至攻虫第5天);C. 常山散推荐剂量组(1. 攻虫前1天给药组;2. 攻虫当天给药组;3. 攻虫第2天给药组;4. 攻虫第3天给药组;5. 攻虫第4天给药组;6. 攻虫第5天给药组)A. Healthy control group; B. Infected control group (1-6 are from 1 day before to 5 days after the attack, respectively); C. Recommended dose group of RDP (1. Dosing group 1 day before attacking worms; 2. Dosing group on the day of attacking worms; 3. Dosing group on the second day of attacking worms; 4. Dosing group on the third day of attacking worms; 5. Dosing group on the fourth day of attacking worms; 6. Dosing group on the fifth day of attacking worms)
表5 常山散对雏鸡感染球虫不同发育阶段OPG及盲肠病变计分的影响
2.3 常山散对雏鸡感染球虫不同发育阶段抗球虫指数的影响
由表6 可知,各试验组鸡存活率基本为100%。随着球虫的不断发育,与Ⅰ组相比较,攻虫后Ⅱ组和Ⅲ组的相对增重率逐渐下降,盲肠病变值差异显着(P<0.05)并呈上升趋势,相较于Ⅱ组,Ⅲ组的相对增重率下降不大,盲肠病变值较低。试验结果显示,攻虫前1天、攻虫当天和攻虫第2天试验组中Ⅲ组的ACI分别为198.83、190.23和165.49,攻虫第3、4和5天试验组中Ⅲ组的ACI分别为150.53、155.00和146.18。
表6 各试验组ACI比较
2.4 常山散对雏鸡感染球虫不同发育阶段免疫功能的影响
2.4.1 对血清免疫球蛋白的影响 由表7 可知:随着球虫在鸡体内的不断发育,Ⅰ组的血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量均显着低于其他两组(P<0.05),Ⅱ组和Ⅲ组的血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量呈不同程度的升高,差异显着(P<0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅲ组3种血清免疫球蛋白含量相对较高。
表7 常山散对雏鸡感染球虫不同发育阶段血清免疫球蛋白的影响
2.4.2 对免疫器官指数的影响 由表8 可知:各试验组中Ⅰ组的脾脏指数和法氏囊指数均显着低于其他两组(P<0.05)。在攻虫前1天、攻虫当天试验设计组中,Ⅱ组和Ⅲ组的脾脏指数差异不显着(P>0.05),在攻虫第2、3、4、5天试验设计组中,Ⅲ组的脾脏指数显着高于Ⅱ组(P<0.05);在球虫发育的各个时期,各试验组中Ⅲ组的法氏囊指数显着高于(P<0.05)Ⅱ组。且随着球虫的不断发育,Ⅱ组和Ⅲ组的免疫器官指数均呈不同程度的升高。
表8 常山散对雏鸡感染球虫不同发育阶段免疫器官指数的影响
3 讨 论
鸡球虫病为湿热症,治疗时应以清热解毒、凉血止泻,辅以补气补虚、健胃益脾为原则[32]。本试验以中兽医理论为基础,选择中药常山治疗肉鸡球虫病,中药常山具有多种药理作用,具有分布广、毒副作用小等特点。本试验采用超声提取技术从中药常山中提取常山浸膏,利用超声波的空化效益和搅拌作用可以充分提取中药有效成分,与传统提取工艺相比提取率显着提高,提取时间大幅缩短[33],但由于提取设备较昂贵,市场上规模化应用较少。从中药常山中提取得到的常山浸膏,可以制备成散剂和口服液;散剂具有生产工艺简单、成本相对较低的优点,但规模化养鸡中拌料不方便;口服液具有易吸收、起效快、抗球虫疗效更好的优点[34],适合集约化养鸡给药,但生产成本相对较高、产品保质期较短。
雏鸡人工经口灌服感染5×104·羽-1柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,患病雏鸡的发病症状比较明显,病死率较低,盲肠病变明显。随着球虫在雏鸡体内的不断发育,各试验处理组中Ⅲ组雏鸡的相对增重率、OPG、盲肠病变评分与Ⅱ组相比差异显着(P<0.05),其中Ⅲ组雏鸡的相对增重率均高于Ⅱ组,表明常山散可有效缓解病鸡体重降低现象;OPG、盲肠病变评分均小于Ⅱ组,证明常山散能够有效抑制球虫的生长发育以及卵囊的排出,在一定程度上能减轻感染雏鸡盲肠病变。
完整的球虫发育史包括孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖3个阶段。本试验中攻虫前1天、攻虫当天和攻虫第2天试验组中Ⅲ组ACI分别为198.83、190.23、165.49,说明在雏鸡攻虫前和球虫感染鸡后发育到子孢子、滋养体阶段给药,常山散具有良好的抗球虫效果;攻虫第3、4和5天试验组中Ⅲ组ACI分别为150.53、155.00和146.18,说明球虫感染鸡后发育到裂殖体、裂殖子阶段给药,常山散的治疗效果较差。张步彩等[35]研究发现,含有常山的中药方剂可以显着降低感染雏鸡的OPG和盲肠病变评分,改善病鸡的增重减轻现象,这与本研究的结果一致。
雏鸡感染球虫后,机体主要产生黏膜免疫和细胞免疫,同时也会引起体液免疫应答作为辅助,通过这些免疫途径抵抗球虫的入侵[36]。动物血液中的抗体水平是衡量机体体液免疫的一项重要指标,机体体液免疫主要通过成熟B淋巴细胞实现[37],B淋巴细胞产生抗体(IgG、IgM、IgA)参与体液免疫,成熟的B淋巴细胞主要存在于血液及淋巴结、脾脏等外周免疫器官中。本研究结果显示,感染柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的雏鸡在饲喂中药常山散之后,雏鸡血液中血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量显着高于(P<0.05)阴性对照组,其中血清免疫球蛋白IgM升高的水平最为显着。以上结果表明中药常山散能够提高感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡机体血液中的抗体水平,提高机体的体液免疫应答,从而增强机体抵抗球虫的能力。
脾脏和法氏囊是禽类最重要的免疫器官,其免疫功能的高低取决于免疫器官的发育状态。动物免疫器官质量增加是由于其自身细胞生长发育和分裂增殖所致,质量增加表明机体的免疫机能提高,所以免疫器官的重量在一定范围内可用于评价雏鸡的免疫能力[32,38]。研究表明,中草药可以提高禽类免疫器官的重量,促进免疫器官的发育以提高免疫器官指数[39]。王福传等[40]研究发现在饲料中添加不同剂量的中草药免疫增强剂可以显着提高雏鸡的免疫器官重量。本试验结果显示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组和Ⅲ组的脾指数和法氏囊指数差异显着(P<0.05)且呈上升趋势,说明柔嫩艾美耳球虫对免疫器官的发育有一定的影响,其中常山散推荐剂量组的各免疫器官指数均不同程度上显着(P<0.05)高于感染对照组,说明常山散能够在一定程度上抑制球虫的发育繁殖,减少其对机体的损害,促进各免疫器官的生长发育,从而增强感染雏鸡的免疫力。
4 结 论
对感染不同发育阶段柔嫩艾美耳球虫的雏鸡在饲料中添加常山散后,在攻虫前1天、攻虫当天(子孢子阶段)和第2天(滋养体阶段)进行给药,连续给药4 d,常山散对球虫生长发育具有显着的抑制能力,抗球虫效果良好。在攻虫第3、4、5天给药,即裂殖体、裂殖子阶段,连续给药4 d,常山散对球虫的生长发育抑制能力降低,抗球虫效果较差。但对于感染雏鸡的免疫功能而言,中药常山散的添加,提高了鸡血液中免疫血球蛋白IgA、IgM、IgG的含量,提高了脾指数和法氏囊指数,整体上增强了病鸡的免疫功能。
