王芳 宋庆高 郭佳男 何苇 陈尚 邹亚莉
(遵义医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，贵州 遵义 563000)
先天性牙槽突裂是口腔颌面部最常见的出生缺陷之一，常伴有唇腭裂的发生。研究[1-2]显示，每4个唇腭裂患者中就有3个合并有牙槽突裂。牙槽突裂的修复在现阶段临床应用最多的方法是二期自体松质骨移植修复。但具体到临床个体病例上，往往由于裂隙周围软组织量不足或者裂隙过大等原因造成植入骨的暴露导致骨移植修复失败，有时甚至根本无法采用植骨的方法，同时还面临在年幼患者中难以获得足够的骨量甚至需要开辟第二术区的风险。另外，由于移植骨的吸收，还有需要二次手术甚至多次手术的风险。本课题组前期实验已经将hAMCs分离培养，并在体外成功诱导为成骨细胞，而且该细胞在与胶原—明胶海绵复合培养的过程中生长良好。本研究旨在探讨应用经诱导分化成骨的hAMCs与明胶海绵载体复合培养后进行移植修复兔牙槽突裂的实验效果。
1 材料与方法
1.1实验动物 购于遵义医科大学实验动物中心健康成年雄性大白兔40只(1.5～2.0 kg/只)。
1.2实验试剂与仪器 本课题组预制的未诱导成骨和已诱导成骨并搭载于胶原—明胶海绵进行复合培养的hAMCs，鼠抗人细胞核抗体(美国Sigma公司)，鼠抗人波形蛋白抗体(美国Sigma公司)，自动显微照相装置(PM20-35，日本Olympus公司)。
1.3牙槽突裂动物模型的建立与修复 用1%戊巴比妥钠(1 mL/kg)经实验动物耳缘静脉注射麻醉后，口内外以碘伏消毒，铺巾，切开牙龈，暴露左右上中切牙和侧切牙远中牙槽突骨面，用牙科电钻在中切牙及侧切牙远中磨除牙槽骨至形成约1.0 cm×0.5 cm的楔形牙槽突裂样缺损，缺损距侧切牙切缘1.0 cm，缝合创口，形成一个双侧完全性牙槽突裂动物模型。待牙槽突裂兔伤口愈合后，1%戊巴比妥钠行耳缘静脉注射麻醉，常规消毒铺巾，沿原切口切开，暴露牙槽突，根据对牙槽突裂不同的移植处理，将牙槽突裂兔随机分为四组：A组(植入负载有hAMCs的胶原—明胶海绵，12只)；B组(植入负载有经诱导成骨的hAMCs的胶原—明胶海绵，12只)；C组(植入未作处理的胶原—明胶海绵，12只)，D组(空白对照，5只)。所有动物在术后半流质饮食1周，之后常规颗粒饲料喂养。
1.4实验标本收集与处理 实验动物于移植后2、4、6、8周分别注射过量戊巴比妥钠，每次处死2只，第12周处死剩余动物，取下动物颅骨(含上颌骨，颧骨及鼻骨等)，剔除软组织，在骨标本上应用游标卡尺直接测量上颌前部移植区牙槽骨厚度。取3次测量的平均值进行统计学分析。将左侧移植区外0.2 cm范围内包括骨，骨膜及肌肉切取下来，4%多聚甲醛固定24 h后，再采用10% EDTA-2Na脱钙4周，石蜡包埋，切片，进行苏木精—伊红染色及抗人细胞核抗体免疫组织化学检测。
2 结 果
2.1牙槽突裂修复大体观察与测量结果 实验动物术后出现术区局部轻度红肿，3～5 d后基本消失，创口均无明显的感染。大体标本观察：A/B/C组术后2周，缺损均清晰可见，缺损内明显纤维结缔组织长入，A/B组未见明显胶原—明胶海绵样组织；术后4周，A/B组缺损变浅，缺损底部骨质疏松，易剥离，C组缺损边缘变圆钝，缺损未见明显变浅；术后6周，A/B组缺损明显变小变浅，缺损内有较多疏松骨质，而C组缺损稍变浅，缺损内侧见少量松软骨质；术后8周，A/B组骨面粗糙，缺损处见大量骨质充填，质地较正常骨质松软，骨缺损交界处近骨质连续，C组缺损处也进一步变小和骨折增多，但缺损仍可见；术后12周，A/B组骨面较光滑，缺损处大量骨质充填，中切牙牙根未暴露，C组骨面粗糙，缺损处也见骨质充填，但仍存在凹陷，D组缺损内侧少许骨质沉积，缺损变浅，中切牙牙根暴露或仅有少许骨质包绕。第12周各组新成骨平均厚度为：A组(4.51±0.43) mm、B组(4.38±0.66) mm、C组(3.19±0.12) mm、D组(3.08±0.09) mm。A组与B组的结果差异无统计学意义(t=-1.389，P>0.05)；A组与C组的结果差异有统计学意义(t=-9.468，P<0.01)；A组与D组的结果差异有统计学意义(t=-9.795 4，P<0.01)；B组与C组的结果差异有统计学意义(t=5.598，P<0.05)；B组与D组的结果差异有统计学意义(t=5.981，P<0.05)；C组与D组的结果差异有统计学意义(t=2.795，P<0.05)。
2.2牙槽突裂修复苏木精—伊红染色结果观察 苏木精—伊红染色光镜观察结果示A组在术后2周成骨细胞不均匀聚集，有新生毛细血管，但没有见明显的钙质沉积(图1A)；术后4周，成骨细胞聚集区细胞和新生毛细血管均较术后2周增多(图1D)；术后6周，成骨细胞聚集区范围增大，细胞数也较前明显增多，明显钙质沉积，类骨质形成(图1G)；术后8周，钙质沉积进一步增多，见新生骨小梁形成(图1J)；术后12周，成熟骨质增多，但骨小梁排列排列较紊乱，仍可见成骨细胞聚集区(图1M)。B组在术后2周视野内细胞较多，见红染的钙质沉积区及新生血管，还可见炎细胞浸润(图1B)；术后4周，见成骨细胞聚集区，钙质沉积区钙质沉积明显，类骨质形成，新生毛细血管和炎细胞较术后第2周减少(图1E)；术后6周，新生骨质较术后第4周明显成熟，见新生骨小梁(图1H)；术后8周，新生骨质较术后第6周更为成熟，新生骨小梁增多(图1K)；术后12周，与术后8周及A组同时期比较，骨小梁排列整齐(图1N)。C组在术后2周骨外侧视野见散在细胞，未见明显成骨细胞聚集区(图1C)；术后4周，骨外侧见细胞成分稍增多，仍未见明显成骨细胞聚集区，脂肪细胞较术后2周增多(图1F)；术后8周，骨外侧见细胞成分较术后4周增多，见成骨细胞聚集和钙质沉积(图1L)；术后12周，骨外侧见大量脂肪细胞(图1O)。
图1 A/B/C组在第2/4/6/8/12周时的苏木精-伊红染色结果(×200)
2.3牙槽突裂修复后抗人细胞核抗体免疫组织化学染色结果 本实验对12周标本进行免疫组织化学染色结果显示：A组B组均可见细胞核呈阳性染色的细胞存活(箭头所指)，而C、D组均未见抗人细胞核抗体阳性染色的细胞(图2)。
注:A组B组均可见细胞核呈阳性染色的细胞存活(箭头所指)，C、D组均未见抗人细胞核抗体阳性染色的细胞。图2 第12周A/B/C组免疫组织化学染色结果(×400)
3 讨 论
牙槽突裂的良好重建可以使上颌牙弓的完整性及上颌骨的稳定性得以稳定有效的恢复，而且还能矫正鼻底塌陷、关闭口鼻漏，为之后二期的正畸、正颌打下坚实的基础[3]。因此，牙槽突裂的重建一直是唇腭裂序列治疗的重要组成部分，随着近年来组织工程技术的兴起，也为牙槽突裂的骨修复提供了新的策略和途径[4]。与传统的自体髂骨松质骨移植相比较，组织工程修复不仅可以明显减少患者的痛苦和总体费用，还可以避免第二术区的开创及其所导致的不良反应。在之前的研究中，本课题组已经成功将hAMCs分离培养，并在体外诱导为成骨细胞，同时发现该细胞能够搭载于胶原—明胶海绵上，且生长良好，可以与胶原—明胶海绵形成复合体。但hAMCs与胶原—明胶海绵复合体在体内的修复效果尚需不清楚，故我们决定通过建立兔的牙槽突裂模型，然后将该复合体移植于兔牙槽突裂处，观察其修复效果。
本实验研究运用牙科涡轮手机切割的手术方式在兔的上颌骨制造一个1.0 cm×0.5 cm大小的缺损，以此建立一个兔的牙槽突裂动物模型，且缺损大小符合兔颌骨的临界缺损[5-7]，造模1个月后X-Ray摄片显示裂隙存在，表明模型构建成功，之后采用hAMCs与胶原—明胶海绵复合体、经诱导后的hAMCs与胶原—明胶海绵复合体、未作处理的胶原—明胶海绵分别修复实验动物的牙槽突裂。目前对于牙槽突裂修复效果评价的方法最常用的是由Bergland等[8]在1986年提出：即根据植入牙槽突裂间隔内的植入骨高度与正常牙槽嵴高度的比例变化，将评价结果分为四型。Ⅰ型：植入骨高度具有与正常牙槽嵴一致的高度；Ⅱ型：植入骨高度达到正常牙槽嵴高度的3/4；Ⅲ型：植入骨高度低于正常牙槽嵴高度的3/4；Ⅳ型：植入骨与牙槽突裂缺损区无骨性粘连，也就是植骨失败。根据这一标准，可在较长的一段时间内对牙槽突植骨术术后的植入骨生长情况进行评价。但是因为本研究的实验动物是兔，而兔的腭部较为扁平，没有明显的牙槽突，所以此方法并不适合，故本实验采用测量第12周牙槽突缺损区骨厚度来评价牙槽突裂的修复效果，即在12周后对移植区骨厚度进行统计学分析，结果显示A组与B组最终效果上没有明显统计学差异。但是苏木精—伊红染色后观察经诱导后的hAMCs钙质沉积较早。A组与C/D组的结果差异有显着统计学意义；B组与C/D组的结果差异有显着统计学意义。大体标本观察，A、B 两组裂隙间见大量骨质充填，裂隙得到修复，而C组见裂隙内侧有骨质充填，但是骨面粗糙，缺损处仍凹陷；D组见中切牙牙根暴露，裂隙变浅存，内侧见薄层骨质；C/D两组同样观察到缺损浅的想象，这可能与缺损内侧骨膜为切除，骨膜内的成骨细胞修复的结果。此外，我们通过免疫组织化学染色对第12周的样本进行检测，A/B组检测到抗人细胞核抗体染色阳性的细胞，但两组间的结果差异无统计学意义，可两组与C组相比，结果差异都有统计学意义，说明了hAMCs及诱导后的hAMCs能够负载于胶原—明胶海绵上并参与了体内成骨及骨重建，为将来人类牙槽突裂的修复重建提供新的策略和途径，但其具体机制有待进一步研究。
本文图1，图2见封三。
