胡晶晶 周伟 胡笑容
(1.钟祥市人民医院心内科，湖北 钟祥 431900；2.武汉大学中南医院，湖北 武汉 430071)
心肌梗死后再灌注治疗是治疗心梗最有效的方法，而再灌注损伤很大程度地限制了再灌注治疗的疗效。心梗后自主神经失衡，表现为交感神经过度激活，迷走神经活性相对减弱是加重心肌损伤和恶性心律失常的重要原因，而再灌注治疗不能降低交感神经活性。研究[1]证实，迷走神经刺激可以通过增加迷走活性，相对抑制交感神经活性减轻心肌缺血再灌注(ischemiaandreperfusion，IR)损伤。因此抑制交感活性可能是治疗心肌缺血再灌注损伤的可靠手段。肾交感消融(renalsympathetic denervation,RSD)是降低心脏交感活性的有效方法[2]，与左侧星状神经节消融为目前临床研究最多的心交感神经消融方法，二者均可治疗高血压和特定类型的室性心律失常，如儿茶酚胺敏感型室速。RSD与心肌损伤研究鲜有报道，前期的研究[3]证实，RSD可以显着抑制心梗模型中心交感活性和心肌氧化应激水平。本研究主要探讨RSD对大鼠IR损伤的影响及可能机制。
1 材料与方法
1.1实验分组与动物模型建立 18只18～20周龄雄性SD大鼠，体质量180～200 g，购于湖北省疾控中心。根据随机数字表分为3组：假手术组，(SO组)：大鼠开腹暴露双侧肾脏，45 min后开胸、前降支下穿线不结扎；缺血再灌注组(IR组)：大鼠麻醉后开腹暴露双侧肾脏，45 min后开胸，结扎LAD 30 min，再灌注4 h；RSD+IR组:大鼠麻醉后开腹，暴露双侧肾脏，行RSD，RSD成功后等待30 min开胸，结扎LAD 30 min，再灌注4 h。
1.2RSD 暴露双侧肾脏后，剪断肾门和肾动脉所有可见神经纤维，为保证RSD效率，用棉签蘸取10%乙醇苯酚溶液湿敷肾门和肾动脉15 min。
1.3建立动物模型 大鼠采用2%苯巴比妥钠腹腔麻醉(45 mg/kg)，将大鼠仰卧位固定于恒温板上，剔除颈部、胸部和内侧腹部毛发，在环状软骨下2节气管插管(70 bpm，吸呼比1∶1.5，潮气量1 mL)。沿腹部切口分离双侧肾脏，后沿左侧胸部切口暴露心脏，剪开心包膜，在左心耳下2 mm处将LAD与中空带凹槽的乳胶管结扎，结扎后远处心肌变白表明结扎成功，缺血30 min后，剪断结扎线，再灌注4 h。
1.4ELisa 检测血清肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)评价心肌损伤情况，检测心肌组织间NE(interstitial norepinephrine，iNE)浓度，评价交感神经活性。经大鼠颈静脉采血，离心(3 000 r×15 min)后取上清检测。采用Elabscience公司试剂盒，严格按照说明书操作。检测范围：CK-Mb：31.25～2000 pg/mL；cTnI：31.25～2000 pg/mL；iNE：0.31～20 ng/mL。
1.5生物化学检测法 检测缺血区心肌(梗死心肌周围5 mm内)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-Aoc)，评价心肌组织氧化应激水平和抗氧化能力。选用南京建成生物工程研究所试剂盒，严格按照说明书操作。
1.6Western blot法 检测缺血区心肌Beclin-1、LC3- Ⅱ评价心肌细胞自噬水平。匀浆后测定总蛋白浓度，每孔上样量为40 μg，跑胶、转膜后，与一抗(Beclin-1：1∶500稀释，Abcam；LC3：1∶500稀释，北京博奥森生物技术有限公司)4℃孵育过夜，与相应的二抗孵育后，ECL法显色。
2 结 果
2.1心肌损伤 与SO组比较，IR组血清CK-Mb和cTnI表达均显着增加。与IR组比较，RSD可以显着降低血清CK-Mb和cTnI的表达。见表1。
表1 血清CK-Mb、cTnI及心肌组织iNE的表达
2.2心肌组织NE浓度 与SO组比较，IR组心肌组织中NE浓度显着增加；与IR组比较，RSD组中NE浓度显着降低。见表1。
2.3心肌氧化应激水平 与SO组比较，IR组缺血区心肌组织氧化应激水平(MDA)显着增加，抗氧化能力(SOD，T-Aoc)显着减弱；与IR组比较，RSD可以减轻缺血区心肌组织氧化应激水平，增加抗氧化能力。见表2。
表2 心肌MDA表达以及SOD和T-Aoc活性
2.4心肌自噬水平 与SO组比较，IR组中Beclin-1表达水平(0.75±0.11 VS 0.18±0.024，P<0.05)和LC3-Ⅱ(0.32±0.048 VS 0.087±0.0068,P<0.05)显着增加；与IR组比较，RSD可以显着抑制Beclin-1的表达(0.47±0.051，P<0.05)和LC3- Ⅱ(0.21±0.032，P<0.05)的表达。见图1，表3。
图1 Beclin-1和LC3-Ⅱ相对表达量
表3 心肌组织Beclin-1和LC3-Ⅱ相对表达
3 讨 论
RSD为心交感消融的有效方法，前期大量研究[4-5]表明，RSD可以通过抑制心交感过度激活降低患者血压以及缺血后房性、室性心律失常以及心衰的发生。RSD可以通过下丘脑室旁核，延髓头端腹外侧，双侧星状神经节支配心脏交感活性。我们前期研究证实，RSD可以显着抑制心梗后左侧星状神经节活性，即心交感活性，抑制室性心律失常的发生。本研究发现，RSD可以显着抑制心肌组织NE水平，进一步印证了RSD为心交感消融的有效方法，可以显着抑制IR中心交感过度激活。
交感过度激活是加重心肌IR损伤的重要因素，前期B.Buchholz等[6]研究证实，通过长时间低强度迷走神经刺激可以激活交感神经，进而加重心肌IR损伤，而这种作用可以完全被倍他乐克阻断。组织中过高浓度的NE也是加剧IR损伤的重要因素，血清中NE浓度的过高也提示了不良预后[7-8]。本研究发现RSD可以显着抑制心肌IR损伤，降低组织NE浓度，因此我们推测，RSD可以通过抑制交感活性和NE浓度减轻心肌IR损伤
心肌缺血时，氧供中断、ATP耗竭，为保证机体所需，交感激活，增加心肌收缩力和心率，进一步加剧耗氧，导致心肌抗氧化能力耗竭，再灌注时富氧血流再通，引起局部心肌氧化/抗氧化失衡，氧化应激水平激增。过高的氧化应激水平可以持续开放线粒体膜通透性转换孔，诱导线粒体肿胀破裂，呼吸链中活性氧大量释放，进一步加重氧化应激。有研究表明，离断交感神经可以减轻肝脏IR中氧化应激水平[9]。NE可以通过NADPH途径诱导外周血单核细胞产生活性氧[10]。RSD减轻脑中氧化应激水平[11]，肾盂积水模型中，肾脏的氧化应激水平[12]。结合本研究结果我们推测，RSD可以通过抑制交感过度激活和组织中NE表达减轻大鼠心肌氧化应激水平，增加抗氧化能力。
自噬是心肌IR损伤的重要机制，目前普遍认为在缺血期自噬可以清除受损蛋白和细胞器，促进细胞存活，为保护机制，而再灌注时，由于自噬过度激活，可以促进细胞凋亡，为损伤机制。自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬，其中巨自噬为自噬的主要形式，损伤的细胞器或者大分子蛋白被双层质膜包裹形成自噬小体，与溶酶体结合降解。目前认为VPS34-VPS15-Beclin-1复合物是激活自噬小体形成的关键酶复合物，其参与了磷脂酰肌醇(PI)磷酸化形成PI3P，而PI3P为形成自噬小体的必需物质。LC3-Ⅱ泛素化复合物是自噬小体形成的另一个重要介质，LC3-Ⅱ分布在自噬小体上，与溶酶体结合后降解，因此LC3-Ⅱ反应了自噬的水平。本研究发现RSD可以显着抑制心肌组织Beclin-1的表达，降低LC3-Ⅱ的表达即抑制细胞巨自噬的水平。氧化应激可以通过多种途径调节自噬水平，研究表明，过量活性氧可以通过抑制PI3K-Akt-mTOR通路、激活AMPK通路、抑制Atg活性等引起细胞内Beclin-1和LC3-Ⅱ的聚集，激活自噬[13]。因此我们推测RSD可以通过抑制氧化应激减轻心肌自噬水平。
综上所述，RSD为心脏交感神经消融的有效方法； RSD可以通过抑制交感神经活性减轻大鼠心肌氧化应激和自噬水平，进而减轻大鼠心肌IR损伤； RSD减轻大鼠心肌自噬可能与抑制氧化应激有关。
