杨嘉辉，胡恭华

（1.赣南医学院2017级预防医学专业本科生；2.赣南医学院公共卫生与健康管理学院；3.赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室，江西 赣州 341000）

自噬是一种进化保存的细胞内循环系统和细胞自我降解过程，维持新陈代谢和平衡。自噬过程会受到多种调控因素的影响，比较常见的原因有：DNA 损伤、缺氧和缺乏生长因子等，其对一系列细胞应力有反应，包括营养剥夺、细胞器损伤和异常蛋白质积累。自噬过程也可以与细胞死亡和细胞存活有关［1］，而且自噬功能失调还会导致哺乳动物模型神经退行性疾病，包括亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病和帕金森病。调节性自噬也参与代谢综合征（如肥胖、糖尿病和脂肪肝）和癌症进展。DNA 依赖性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNAPK）在细胞对DNA损伤的反应中、在DNA双链断裂（DNA double strand breaks，DNA-DSBs）的修复中起着关键作用，在维持基因组完整性方面也起着重要的作用［2］。

1 DNA-PK的结构及其功能特性

1.1 编码DNA-PK 基因的染色体定位及其结构人类DNA-PK 由PRKDC 基因编码，PRKDC 基因又称为DnPK1，该基因位于染色体8q11 上，完整的基因组序列跨距约为30 kb。包含PRKDC 的启动子和前9 个外显子，编码人类DNA-PK 酶的催化亚基（DNA-Dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）的基因启动子位于由700 bp分隔的CpG岛中，每个启动子的转录都有多个起始点，但启动子缺少TATA 框［3］。该基因在大多数组织中均有表达，并且在睾丸（RPKM 10.8）、淋巴结（RPKM 10.6）中表达较常见。

1.2 DNA-PK 的结构特性DNA-PK 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在非同源末端连接（Non-Homologous End-Joining，NHEJ）途径中的DNA 双链断裂（Double Strand Breaks，DSB）修复中起着重要作用。DNA-PK全酶是一个由催化亚基DNA-PKcs 和Ku70/80 异质体组成的三元复合物［4］。Ku是一种双链DNA的分子传感器，一旦与DSB 末端结合，它就会将DNA-PKcs招募到DSB 位点。随后，DNA-PKcs 被激活并磷酸化，这些磷酸化将调节DNA-PKcs［5］。DNA-PKcs是一种由4 128个氨基酸（460 kDa）组成的大激酶，由N端区（1-891）、环形支架装置（892-2800）和C端头组成［6］，与ATM（ataxia-telangiectasia mutated），ATR（ATM and RAD3-related），mTOR（mammalian target of rapamyoin，雷帕霉素的哺乳动物靶点）属于磷酸-3-激酶（PI3K）相关激酶（PIKK）家族。Ku70 和Ku80 是从HeLa 细胞中发现的，并被确定为束缚双链DNA 的异质体，是一种自动免疫抗原，它在体外以DNA 依赖的方式磷酸化酪蛋白［7］。DNA-PKcs整体结构由N端形成一个双环状连接到C端头（残基2801-4128；包括FAT、KD、FRB、LBE、PRD和FATC）。双环“臂”结构域可细分为2 个结构实体：N 端单元（残基1-891）和环形支架装置（残基892-2800）［8］。Ku70 和Ku80 的C 终端区域都包含1 个灵活的长链接器和1 个球状结构域。Ku80 C-终端区域（Ku80CTR）（残留物543-732）中的球状域（残留物595-704）由NMR 方法在溶液中确定，由6个螺旋体组成，包括2个“螺旋发夹”结构［9］。

1.3 DNA-PK的功能特性DNA-PK最广为人知的作用就是修复DNA 双链断裂（Double Strand Breaks，DSB）［2］。DSB 可由电离辐射（IR）、活性氧种类和DNA跨缺口复制产生的DNA损伤中产生，是真核细胞中最严重的DNA 损伤［9］，修复失败可能导致细胞死亡、基因组不稳定或肿瘤生成［10］。细胞通过启动强大的DNA 损伤反应（DNA-damage response，DDR）途径来响应DNA 损伤，从而使细胞有足够的时间为特定的DNA 进行修复。现今已知至少有5 条主要的DNA 修复途径：碱基切除修复（Base Excision Repair，BER）、核苷酸切除修复（Nucleotide Excision Repair，NER）、错配修复（Mismatch Repair，MMR）、同源重组（Homologous Recombination，HR）和非同源末端连接（Non-Homologous End-Joining，NHEJ），这5条修复途径在细胞周期的不同阶段都具有活性，使细胞能够修复DNA 损伤。DNA-PK 作为一种DNADSB 传感器和NHEJ 的介体，具有一些独特的性质。例如，DNA-PK 非常丰富：据估计，每个HeLa 细胞中含有大约100 000 个DNA PKcs，远远超过NHEJ 可能需要的量，因为只要1个DNA PKcs与每个DSB端结合。此外，DNA-PKcs 不仅存在于细胞核中，也存在于细胞质中。这些特征表明DNA-PK 可能具有与NHEJ 无关的附加功能［11］。鉴于DNA-PKcs 和Ku 与dsDNA 末端的相互作用，在早期研究中表明DNAPKcs 可能参与转录、DNA 修复和病毒DNA 的检测，DNA-PKcs 和Ku 参与DSB 修复的第一个线索来自缺乏DNA-PKcs 或Ku 的细胞对IR 和其他DSB 诱导剂高度敏感的发现［7］。DNA-PK 在端粒长度的调节中也起着一定的作用，端粒长度由端粒酶和端粒缩短的端粒合成的对立效应控制。DNA-PK 在人类HCT116 细胞系的灭活中缩短了端粒，表明DNA-PK在端粒长度的维持中发挥作用［11］。

2 自 噬

自噬是指细胞用于降解不需要的无用的细胞器、蛋白质和传染性物质以维持平衡的生存机制［12］，是除泛素蛋白酶体系统外，唯一已知的进化保守的蛋白质降解途径。现今已知有3种主要类型的自噬：巨自噬（Autophagy，一般称为自噬），分子伴侣介导的自噬（Molecular chaperone autophagy，CMA），微自噬（Microautophagy）。自噬不仅被认为是细胞的自我保护机制，而且被认为是一种类似于凋亡和坏死的编程细胞死亡机制，在代谢压力下，被认为是保护性的［13］。自噬在所有真核生物中都高度保存，在应激条件下（营养剥夺、氧化应激和DNA 损伤）保持细胞平衡［14］。自噬调节的缺陷在一系列疾病中起着核心作用，包括神经退行性疾病、癌症、病原体感染和代谢性疾病。同样，一旦肿瘤形成，细胞自噬为癌细胞提供更丰富的营养，促进肿瘤生长，抑制自噬则有助于癌症的治疗［15］，但是肿瘤抑制因子p53 引起的细胞死亡同样需要自噬，并且是由一种名为DRAM 的蛋白的p53依赖性上调引起的［16］。自噬的初始阶段被称为成核，涉及Ⅲ类磷脂酰肌醇3 激酶PI3K 的激活；磷脂酰肌醇3 激酶PI3K 是多蛋白复合物的一个组成部分，包括ULK/Atg1复合物（Atg6/Beclin），它使Atg蛋白能够被募集到隔离膜中（也称为吞噬细胞）。囊泡的伸长和完成（即自噬体的形成）受两个泛素样结合系统（Atg12-和微管相关蛋白1A/1B 轻链3（LC3）-共轭结合）控制，这两个系统使Atg5 共价偶联到Atg12，并将LC3-I 转化为其磷脂酰乙醇胺共轭结合形式。自溶体的形成是成熟自噬体与溶酶体融合的结果，允许通过溶酶体水解酶降解靶体，通过Akt 激酶/mTOR激酶信号，PI3K还能够调节细胞生长，进而抑制自噬［17］。因此，自噬主要具有细胞保护功能，需要受到严格调节，以正确响应细胞经历的不同刺激，从而适应不断变化的环境［18］。

3 DNA-PK 在自噬过程中的作用及其可能机制

近几年来，关于DNA-PK 在自噬中的作用及其机制的研究已有了一定的进展。但大多数阐述的是在巨自噬中的作用，在微自噬与分子伴侣介导的自噬中较少提及。下面将从巨自噬、分子伴侣的自噬和微自噬3个方面阐述DNA-PK在自噬中的作用。

3.1 DNA-PK 在巨自噬中的作用巨自噬是一种进化保守的动态途径，主要以降解方式发挥作用。细胞基础水平的巨自噬发生是组成性的，但这个过程可以进一步诱导对各种类型的应激反应，包括饥饿、缺氧和激素的刺激。巨自噬背后的一般原理是，细胞质内的物质可以被隔离在一个短暂的双膜细胞器内，自噬体随后与溶酶体或液泡（分别在哺乳动物、酵母和植物中）融合，启动内容物降解，然后回收产生的大分子［19］，巨自噬是细胞清除受损细胞器和其他相关碎片的主要或普遍的途径，此后，术语“自噬”表示巨自噬［15］。有研究发现在利用烷基化剂替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）治疗人类胶质瘤细胞DNA 损伤引起衰老的相关模型中发现，急性DNA 损伤导致PRKAA/AMPK-ULK1 和MAPK14（一种蛋白激酶）活化，并持续降低对Akt-PI3K-mTOR通路的调节，导致自噬的短暂激活，随后衰老。DNA 损伤激活H2AFX/H2AX-ATM 通路，随后激活上皮细胞中的AMPK-ULK1 和自噬。抑制自噬可引起细胞凋亡，减少衰老，而激活自噬可增加衰老，说明DNA 损伤诱导自噬是通过抑制细胞凋亡来实现的。事实上，在TMZ 治疗后，DNA 损伤修复蛋白可能是AMPK-ULK1 轴激活的信号，它可以直接通过激活PIK3C3/VPS3442 来触发自噬［20］。DNA 损伤中最严重的是DSB，而DNA-PK是哺乳动物DSB修复中的关键蛋白质，有助于维持基因组完整性［21］。前文已经介绍了DNA-PK 可修复DSB，并且DNA-PK 可通过NHEJ 修复DSB，而无法修复的严重DNA 损伤可导致的持续不断的自噬，进而诱发一种称为“自噬细胞死亡”的细胞死亡形式，若修复不全将导致自噬在低DNA 损伤水平下促进生存和耐药性［21］，并且在对慢性淋巴细胞白血病的早期研究中也表明，DNA-PKcs 活性的增加与对化疗的耐受性和不良结局相关，同样在胃癌中也有报道DNA-PKcs 表达升高，并发现与卵巢癌和肝细胞癌患者的不良临床结局相关［22］。因此DNA-PK 的表达对自噬在癌症中是起到细胞保护作用还是细胞毒性作用有极大影响。在骨肉瘤细胞中，DNA-PK 作为抗药因子的存在，骨肉瘤（OS）是儿童和青少年癌症相关死亡的主要原因之一［23］，应用一些DNA-PKcs 抑制剂时（包括NU7026，NU7441 和LY294002），发现DNA-PK 抑制剂在OS 细胞中具有显着效果，并可增强盐霉素（新型的抗OS 剂）诱导细胞毒性［24］，有学者发现盐霉素在OS 细胞中的作用也可以诱导AMPK 下游的细胞保护性自噬激活，AMPK 是细胞凋亡的负调节因子，自噬的诱导通常伴随着微管相关蛋白Beclin-1 的增加。研究发现盐霉素也增加了U2OS细胞中Beclin-1的表达，DNA-PKcs 是盐霉素诱导的OS 细胞自噬激活所必需的，而DNA-PKcs 抑制剂在很大程度上抑制了USO2 细胞中盐霉素的自噬激活，表明盐霉素诱导的Beclin-1 表达需要DNA-PKcs。单独敲除Beclin-1 shRNA 还可诱导U2OS 细胞轻微死亡和凋亡，这表明基础自噬激活对USO2 细胞的存活很重要［25］。此外miR101 的表达，是一种抗DNA-PKcs 的miRNA［26］，会下调DNA-PKcs 的表达，增强盐霉素对OS细胞的杀伤力，说明DNA-PKcs是盐霉素诱导自噬激活所必须的，这有利于OS细胞存活。DNA-PKcs在许多癌细胞中的过度表达介导Akt-mTOR 信号的激活，Akt-mTOR 信号是一种主要的促生存和化疗耐药信号，DNA-PKcs可与Akt形成复合物，使Akt活性提高10倍，从而激活促生存自噬［25］。并且DNA-PKcs具有修复受损DNA 的能力，DNA 损伤常见于OS 细胞和许多癌细胞，是一种重要的凋亡抵抗因子［27］，DNA-PKcs的存在不利于凋亡的进行，而且DNA-PKcs是自噬激活所必须的，这有利于OS 细胞的存活［25］。总之，DNA-PK 在促进巨自噬方面的作用有较好的阐述，但是根据癌细胞类型不同，药物作用不同，细胞DNA 损伤程度不同，DNA-PK 对细胞自噬是否又有不同的作用还需要更深层次的研究。

3.2 DNA-PK 在分子伴侣介导的自噬与微自噬中的作用多年来，伴侣介导的自噬（CMA）研究的重点已经发生改变。早期的研究强调优化体外重组CMA 系统，这有助于理解伴侣内容物识别和底物溶酶体转位，CMA 的分子分离研究一直进展很慢，后续的研究发现模型系统如酵母、蠕虫或苍蝇在CMA研究中没有用处，因为这些物种中缺乏CMA 的基本成分，迄今为止仅在鸟类和哺乳动物中进行了描述。基因调节CMA 的能力一直是将CMA 功能失常与人类疾病（如神经退行性变和癌症）联系起来的关键。CMA 是第一个被研究的过程，它表明溶酶体对细胞内成分的降解是有选择性的，细胞器蛋白质与液泡、溶酶体或晚期内分体处的表面蛋白质相互作用而发生选择性细胞器降解，而胞浆伴侣热休克同源蛋白（Hsc70；也称为HspA8）71 kDa可导致细胞器的选择性降解［28］，Hsc70 最初通过与靶蛋白和溶酶体膜蛋白LAMP-2A 的相互作用，将Hsc70 识别为伴侣介导自噬的关键因子，而且在微自噬的情况下，Hsc70 被证明是通过溶酶体膜蛋白和磷脂之间的静电相互作用被招募到晚期内体中的磷脂酰丝氨酸［29］，通过微自噬介导选择性蛋白质降解（在哺乳动物中称为内体微自噬）。由于溶酶体货物传递的独特机制，自发现以来，选择性一直与CMA 有关，但不是所有的蛋白质都能通过CMA 降解，要成为CMA 底物，蛋白质必须在其氨基酸序列中包含特定的靶向基序，选择含有五肽图案（KFERQ）的特定细胞酸蛋白，特定的五肽图案称为KFERQ。该基序与胞浆伴侣蛋白（HSC70）结合，将底物蛋白带到溶酶体表面进行内化和快速溶酶体内降解［28］，如哺乳动物类Ste20 样激酶1（MST1；也称为STK4）在远离典型CMA 基序的残基中的乙酰化可阻止其溶酶体降解，并且只有在脱乙酰基化之后，Hsc70 才能与典型基序结合［30］，目前，Hsc70 仍然是唯一被证明直接结合基序的伴侣。与CMA一样，Hsc70通过KFERQ样基序与核内体微自噬货运蛋白结合。因此，Hsc70是哺乳动物3种不同自噬类型之间蛋白质分类的中心，Hsc70 从胞浆内化到晚期内质体可能是通过微自噬发生的，而溶酶体-内质体融合促进了Hsc70 向溶酶体腔的转移［28］。在微自噬过程中，溶酶体或内质膜直接内化囊泡中的细胞质物质或通过Hsc70 伴侣内化［31］，负责内质微自噬作用的Hsc70 表现出一种膜变形活性，独立于其伴侣活性［32］。最近研究发现热休克蛋白HspA8/Hsc70 是DNA-PK抗病毒途径中诱导磷酸化的靶点，揭示了人类细胞中存在一种不依赖于DNA传感途径（SIDSP）的传感器、下游靶点的病毒拮抗剂，DNA-PK-SIDSP存在于人类、灵长类动物和大鼠体内，实验中进行了两种不同的DNA-PK激活方式，这些DNA 损伤剂都能很好地激活DNA-PK［33］，但都不能激活或使HspA8 磷酸化，作为对照，实验还诱导了一个强有力的内质网（ER）应激反应使HspA8 磷酸化，研究表明DNA-PK 可以触发细胞对外 源DNA 的反应并磷 酸 化HspA8［34］。DNA-PK 在特定情况如外源DNA 损伤时激活热休克蛋白HspA8/Hsc70，而热休克蛋白HspA8/Hsc70 在伴侣自噬与微自噬中可导致细胞器的选择性降解，对伴侣自噬和微自噬有促进作用，由此可看出DNA-PK通过该方式影响伴侣自噬和微自噬。

综上所述，DNA-PK在各种类型的自噬中起着重要的作用。而DNA损伤引起PRKAA/AMPK-ULK1和MAPK14等蛋白激酶暂时性激活及AKT-PI3K-mTOR通路的持续抑制也在DNA-PK 对细胞自噬的调控中发挥着辅助性作用。近年，DNA-PK 及其与自噬分子机制的关系得到了初步的研究。DNA-PK 及其相关因子的研究为揭示对细胞自噬的影响机制奠定了一定的基础。本文阐述了DNA-PK 在细胞自噬中有着至关重要的作用，包括调节自噬体的形成、囊泡的转移及癌症细胞促生存自噬与促死亡自噬的发展，但DNA-PK 对于细胞自噬的确切功能和影响自噬体形成机制仍在研究中。