汤荣睿，龚雅利

（重庆市沙坪坝区人民医院检验科 400030）

Rho蛋白家族通过其调节子、效应子，影响肿瘤的发生、生长、浸润及转移［1］，其各成员在肿瘤的发展进程中起着不同的作用。据此人们推测Rho蛋白及效应子可为抗瘤靶点，抑制其作用可为发现新的治疗靶点提供理论依据。作者介绍昆布多糖硫酸酯（laminarin sulphate，LAMS）对Rho C蛋白表达的影响及其效应，为进一步临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 鼠抗人Rho蛋白抗体（美国Santa cruz公司），电泳试剂盒（武汉博士得公司），发光试剂盒（美国GE公司），蛋白提取液（武汉博士得公司），Transwell侵袭小室（美国Costar公司），ECM胶（美国sigma公司），图像分析系统（美国BID－RAD公司 Chemi DOCXRS），QGY－7701细胞（中科院上海细胞所）。

1.2 方法

1.2.1 LAMS 由重庆市普外科重点实验室提供，多糖酯含量30%。用生理盐水稀释成120μg／mL，0.22μL孔径滤器过滤。

1.2.2 细胞培养 用含10%胎牛血清的1640培养液在37℃、5%CO2培养箱培养QGY－7701细胞，成对数生长后，实验组加入终浓度分别为12μg／mL及6μg／mL的LAMS，对照组加入20μL生理盐水，培养12h，换不含LAMS的培养液继续培养24h，取细胞用于下述实验（各组一式3份）。

1.2.3 Transwell小室侵袭实验 ECM胶包被小室底膜，紫外线消毒。小室置24孔培养板。取上述细胞，用含10%胎牛血清1640培养液配成1×105。小室内加600μL上述细胞液，小室外加600μL胚胎成纤维细胞培养上清液。37℃、5%CO2培养24h。用棉签擦去孔内细胞，无水乙醇固定，台盼蓝染色。显微镜下计数10个视野的细胞数。

1.2.4 测定Rho C蛋白表达 用细胞刮刮取上述的QGY－7701细胞，置微量离心管内，震荡混匀后置4℃、30min，取匀浆置离心管中12000r／min离心20min。取上清液测定蛋白含量，用蛋白提取液将蛋白浓度均调至3mg／mL。将该组织液经100g／L十二烷基硫酸钠－聚丙稀酰胺凝胶电泳（SOSPAGE），电转于PVDS膜，50g／L脱脂奶粉的TBST溶液封闭，经一抗及二抗孵育后，化学发光法显色，图像分析系统拍摄并用Quantity One软件将特异条带灰度数字化。

1.3 统计学处理 实验数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，实验结果采用表示，采用t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 穿过多孔膜膜细胞数目 对照组、LAMS终浓度6μg／mL、12μg／mL穿过多孔膜的细胞数分别为:220±16、82±6、31±5。LAMS终浓度为12μg／mL组较其他两组有显着降低（P＜0.01）。LAMS终浓度为6μg／mL组亦较对照组有显着降低（P＜0.01）。

2.2 Rho C蛋白表达 MTA1蛋白表达见图1，Rho C蛋白表达系数见表1（Rho C蛋白表达系数＝Rho蛋白积分光密度／βactin蛋白积分光密度）。由图1及表1可见经LAMS处理后QGY7701细胞的Rho C蛋白表达显着降低（P＜0.01）。

图1 Rho C蛋白表达

表1 Rho C蛋白表达系数（）

表1 Rho C蛋白表达系数（）

＃:P＜0.01，与LAMS 12μg比较；＊:P＜0.01，与 LAMS 12μg／mL组比较。

组别 Rho 蛋白表达对照组 1.72±0.22＃＊实验组LAMS 6μg／mL 111.00±0.17＃LAMS 12μg／mL 0.43±0.26

3 讨 论

Rho家族蛋白是一类小分子G蛋白，现已发现十余种成员［2］，该家族具有GTP酶活性，是细胞信号传导通路中的信号转换器［3］。研究发现肿瘤的浸润、转移所涉及的许多分子事件均有Rho蛋白家族成员参与。它们通过调节细胞运动［4］、与细胞黏附［5］、促进细胞间质降解［6］、促进肿瘤血管生成［7］等功能，参与肿瘤细胞的浸润和转移。深入研究Rho蛋白家族成员，具有潜在而重要的临床价值。Rho C蛋白属于Rho CTP酶家族成员，它通过参加细胞骨架的重组，基因转录调控以及细胞信号转导等生理过程，促进细胞癌变［8］。有文献指出Rho C在人类黑色素瘤细胞系中是迁移和转移的关键因子［9］。Wang等［10］应用 RT－PCR及 Western－blot法测定不同分化程度肝癌组织中Rho C的表达，发现Rho C在肝癌组织中的表达高于癌旁组织，在低分化肝癌组织中的表达高于高分化肝癌组织。Rho C的表达水平不但与癌组织的恶性程度有关，且与癌组织的侵袭转移密切相关，可作为肝癌诊断的标志物和治疗的靶点［10］。

本实验结果显示，LAMS可降低QGY7701细胞的Rho C蛋白表达及侵袭力，其效果与浓度呈正相关，有可能成为抗击肿瘤转移的药物。

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［3］Lozano E，Betson M，Braga V.Tumor progression:Small GTPases and loss of cell－cell adhesion［J］.Bioessays，2003，25（5）:452－468.

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［5］Shewan AN，Maddugoda M，Kraemer A，et al.Myosin 2is a key rho kinase target necessary for the local concentration of E－cadherin at cell－cell contacts［J］.Mol Biol Cell，2005，16（10）:4531－4542.

［6］Turner NA，O′Regan DJ，Ball SC，et al.Simvastatin inhibits MMP－9，secretion from human saphenous vein smooth muscle cells by inhibiting the RhoA／ROCK pathway and reducing MMP－9mRNA levels［J］.FASEB J，2005，19（7）:804－806.

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［9］Clark EA，Golub TR，Lander ES，et al.Genomic analysis of metastasis an essential role for Rho［J］.Nature，2000，406（3）:532－556.

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