李春丽，梁仲城，兰贵斌，梁林慧
(广西壮族自治区百色市人民医院检验科 533000)
过量的铝会危害人体健康，诱发免疫系统、神经系统的病变[1]，但铝及其化合物能否引起生殖系统的损害仍存有争议[2]。广西是我国主要铝产地之一，明确及评估过量铝是否引起人体生殖系统的危害是本地区公共卫生领域亟待解决的问题。早老素相关菱形(presenilin associated rhomboid like，PARL)蛋白是组成线粒体膜菱形蛋白成分之一，在保持线粒体形态、调控线粒体功能中具有重要作用[3]。目前有研究提示精子形成及获能中，PARL蛋白起到重要作用[4]。本研究旨在探讨铝暴露工人精子线粒体PARL蛋白水平与精子功能的相关性，以及线粒体PARL蛋白水平下调的分子机制。从而为防治铝生殖毒害提供全新视角。
1 资料与方法
1.1一般资料 选取广西某大型铝企业铝作业男性工人162名，作业工种为熔炼工(64名)、焊接工(42名)及电解工(56名)，设为试验组。纳入标准：(1)连续3年及以上时间从事铝作业；(2)未接触引起精子质量受损的有害环境因素，如多环芳烃、锰、汞、铅、高温等；(3)在标本采集前2周内未服用任何影响生殖系统功能或精子质量的药物；(4)依从性良好。排除标准：(1)患有如冠心病、糖尿病、高血压等慢性疾病及恶性肿瘤；(2)曾罹患如生殖器官受损、甲状腺炎等影响精子质量的疾病；(3)酗酒、吸烟，年龄超过60岁。选取162名该企业下属非直接从事铝暴露作业的服务公司男性工人，作业工种为电工(66名)、钳工(45名)和锅炉工(51名)，设为对照组。两组研究对象在年龄、工龄、饮酒、吸烟及文化程度等差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。研究过程遵循知情同意原则，并通过本院医学伦理委员会批准。
1.2标本采集
1.2.1血液与尿液 抽取及收集各研究对象静脉血5 mL及尿液6 mL，静脉血分别注入干燥管和乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝管中。EDTA-K2抗凝管充分混匀后，置4 ℃冰箱短时(<7 d)保存，用于PARL基因C44055G多态性检测；干燥管静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，分离血清置-20 ℃冷冻保存，尿液加入6 mol/L适量盐酸预贮存，置于-20 ℃低温冰箱中保存，用于测定血清及尿液中铝元素。
1.2.2精液 研究对象禁欲3～7 d后，采用手淫法采集精液标本，置于无菌容器中，用于精子常规检测、精子线粒体PARL蛋白的水平测定。精液标本的保存及处理参照世界卫生组织人类精液检查与实验室手册(第5版)[5]。
1.2.3作业环境铝元素检测 在电解、配料及铸造3个铝作业车间及对照组工作环境，各布置15个采样点，每个采样点采集3个标本。采样严格按照《工作场所空气中有害物质监测的采样规范(GBZl59-2004)》的要求，使用醋酸纤维滤膜定点连续采集空气中铝尘标本。
1.3仪器与试剂 AAS Zeenit 600石墨炉原子吸收光谱仪(德国耶拿仪器公司)、安捷伦GCMS高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)、Lab-aid820致善核酸提取仪(厦门致善生物科技有限公司)、ABI-9700核酸扩增仪(美国ABI公司)、超微量紫外分光光度计(美国赛默飞世尔公司)、电泳仪(北京六一仪器厂)、凝胶成像仪(珠海黑马公司)；线粒体PARL检测试剂(台湾Abnova公司)、DNA 抽提试剂(厦门致善生物科技有限公司)、引物(上海生工公司)、PCR扩增试剂(大连TaKaRa公司)。
1.4方法
1.4.1血清和尿液中铝水平测定 血清及尿液中铝水平的测定采用高效液相色谱法检测，实验具体操作参照参考文献[6]。
1.4.2作业环境铝水平检测 石墨炉原子吸收光谱法测定作业环境铝水平，实验详细操作参照美国国立职业安全与健康研究所(NIOSH)推荐的环境铝水平测定。
1.4.3精液常规分析 精液常规检测由专业实验技术人员完成。主要检测指标为外观、精液量、液化时间、pH值、黏稠度指拉丝、精子存活率、凝集、精子密度和圆细胞。
1.4.4精子线粒体PARL蛋白水平检测 精子线粒体PARL蛋白水平测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测，试验严格按照试剂说明书操作。
1.4.5PARL基因C44055G多态性检测
1.4.5.1DNA制备 全血DNA的制备采用致善全自动核酸提取仪提取，严格按照试剂说明书操作，提好的DNA置-20 ℃冰箱保存备用。
表1 两组研究对象一般资料比较
1.4.5.2C44055G检测 引物：根据GenBank提供的PARL基因启动子序列，用Primer 5.0 软件设计引物，上游引物序列 5′-TGAAGTCGCTGAAATGATAGG-3′，下游引物序列5′-ACAGTAGGGTGAAGGGTAT-3′。PCR反应体系：PCR混合反应液8 μL(含d NTP、buffer)，Taq酶1 μL，无菌水37 μL，DNA模版2 μL和上、下游引物各1 μL，共50 μL反应体系。扩增条件：94 ℃ 5 min预变性；在较高退火温度渐降循环8次：94 ℃ 30 s，从67 ℃至60 ℃每次渐降1 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，24个循环；72 ℃延伸7 min。
1.4.5.3基因位点-限制性片段长度多态性分析 酶切体系：PCR扩增产物20 μL，buffer 3 μL，BstNI内切酶1 μL，无菌水6 μL，共30 μL反应体系。置37 ℃水浴1 h。PCR产物为545 bp(C等位基因)，酶切后为377 bp 和168 bp 的两个片段(G等位基因)。水浴后产物经琼脂糖凝胶(2.0%)电泳验证(100 V电压,电泳30 min)，凝胶图像分析仪观察电泳结果并保存。
1.5问卷调查 通过自行设计的问卷对研究对象进行社会经济状况、营养状况、工作岗位及年限、吸烟、饮酒情况、既往疾病等进行调查，同时结合企业每年的体检资料，获取职业性铝暴露史及既往疾病史或服药状况等。
2 结 果
2.1两组作业环境铝、血清铅、尿液铝水平的检测结果 与对照组比较，试验组的作业环境铝、血清铅及尿液铝水平显着升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。Pearson相关性分析结果显示，血清铝水平与尿液铝水平呈正相关(r=0.841,P=0.018)；作业工龄与尿铝、血清铝水平均呈正相关(r尿铝=0.525,P=0.021；r血清铝=0.621,P=0.016)；尿铝、血清铝水平与作业环境铝水平的相关性差异无统计学意义(r尿铝=0.238,P=0.069；r血清铝=0.261,P=0.056)。
2.2两组受试对象精液常规及精子线粒体PARL蛋白水平检测结果比较 与对照组比较，试验组精子存活率、精子活力及线粒体PARL蛋白水平均明显降低，精子畸形率却显着升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组间其余精液指标虽有差异，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。 相关性分析结果显示，精子线粒体PARL蛋白水平与精子活力、精子存活率呈正相关(r精子活力=0.713,P=0.012；r精子存活率=0.628,P=0.008)；而精子畸形率与精子线粒体PARL蛋白水平表现为负相关(r精子畸形率=0.953,P=0.002)。
表2 两组作业环境铝、血清、尿液铝水平测定结果比较
表3 两组精液常规检测结果及线粒体PARL蛋白水平比较
续表3 两组精液常规检测结果及线粒体PARL蛋白水平比较
2.3两组研究对象PARL基因C44055G多态性检测结果比较 经H-W平衡检验，两组的PARL基因C44055G差异无统计学意义(P>0.05)，符合H-W 群体遗传平衡法则，具有群体代表性。试验组的CG及GG基因型的分布频率高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。进一步分析发现不同基因型间精子线粒体PARL水平差异有统计学意义(P>0.05)。组间两两比较结果表明，GG基因型PARL水平显着低于CG 和CC型(P<0.05)，CG型、CC型之间的男性PARL水平差异也有统计学意义(P<0.05)，见表5、图1。
表4 两组PARL基因C44055G检测结果[n(%)]
表5 PARL基因不同基因型精子线粒体PARL蛋白水平
a：P<0.05，与GG基因型比较；b：P<0.05，与CG基因型比较
1～2：GG基因型；3～4：CG基因型；5～7：CC基因型
图1PARL基因C44055G电泳图
3 讨 论
随着铝矿的开采、炼铝，铝制品的加工、使用及食品添加剂的广泛应用，过量的铝通过呼吸道、消化道等多种途径进入人体。进入人体的铝元素以AI(H2O)3+的形式与血液中的清蛋白、转铁蛋白或枸橼酸离子结合，并随血液分布与脑、肺、肝、肾、骨等组织中。因此过去认为血液和尿液铝浓度可以作为反映铝暴露水平的监测指标。但部分研究认为血清铝水平并不能敏感地反映铝暴露情况[7-8]。本研究结果表明，广西某大型铝企业的铝作业工人主要通过呼吸道摄入过量的铝，进而引起机体血清铝和尿液铝水平显着升高，且血清铝、尿液铝之间呈正相关，这与GUPTA等[7]认为血铝不能真实地反映铝暴露情况的结论相悖。进一步的相关性分析发现血清铝、尿液铝水平均与铝作业工龄呈正相关，提示铝暴露不仅引起铝作业工人血清铝和尿液铝的水平升高，而且随着铝暴露时间的增加，铝可在体内蓄积，进而引起血清铝和尿液铝的水平显着升高；同时，这一结果也提示从事铝暴露作业工作应适当调整、控制铝暴露时间或限制工作的年限，以减轻铝暴露对作业工人的损害。
有研究表明，高浓度铝可能是影响精子生成及数量的高危环境因素[9]。ZHU等[10]发现给予120 d铝暴露后的大鼠精子数量、质量显着降低。而HADI等[11]以18 mg/kg的高剂量氧化铝饲养雄性大鼠30 d后，发现大鼠精子数量、精子活力及畸形精子率明显改变，但精子功能损伤并不严重，提示铝暴露时间对动物生殖功能的影响至关重要。本研究发现，较对照组，试验组的精子活力、精子存活率明显下降，畸形率显着增高。两组在精液量、pH、黏稠度指拉丝、液化时间、凝集、精子密度和圆细胞等差异并无统计学意义(P>0.05)。分析原因可能是：铝所引起的生殖毒性，受铝暴露途径、水平、时间、频率、年龄、个体差异等诸多因素的影响，因此国内外研究结论存在明显的差别[12]。
诸多研究表明铝暴露能够诱发精子功能损害，但其具体的毒性作用机制仍不清楚。PARL蛋白是位于线粒体内膜上的跨膜螺旋结构蛋白， 参与了线粒体的形态改变、线粒体融合及线粒体通路的细胞凋亡等过程。有研究认为精子线粒体上的PARL蛋白是精子生成的关键性调控蛋白，同时也是精子线粒体获能及能量补给的主要因子[13]。人的PARL基因位于人类染色体3q27，由10个外显子和9个内含子组成。有研究发现发现7号外显子44055位点的C/G突变(C44055G)，导致PARL第262位的亮氨酸被缬氨酸替换(Leu262Val替换)，这替换进而影响PARL蛋白第4跨膜区保守氨基酸的改变，从而导致了PARL分泌减少或活性降低。进而导致线粒体数量、形态和功能的改变，从而引起机体生理功能的改变[14]。本研究发现，铝暴露工人的精子线粒体PARL蛋白水平明显降低，且与精子活力、存活率、精子畸形率相关,说明过量铝可能引起PARL蛋白水平的降低，进而导致精子供能系统失衡，诱发精子活力下降，同时启动精子细胞凋亡，继而精子存活率降低等不良结局[15]。在本研究中，铝暴露作业工人PARL基因CG及GG基因型的分布频率明显高于对照组，但差异并无统计学意义(P<0.05)，但分析原因可能是：(1)PARL基因Leu262Val替换不是导致广西铝暴露工人精子线粒体PARL水平低下的原因。这与HADI等[11]研究PARL蛋白基因Leu262Val多态性与2型糖尿病的结论相一致，但与CURRAN等[14]认为高加索人PARL基因Leu262Val替换严重影响线粒体的数量及结构，导致线粒体供能不足进而细胞凋亡的结论不一致(研究对象的种族不同，基因遗传规律存在差异)；(2)PARL基因C44055G多态性可能是广西铝暴露工人精子质量下降危险因素，但引起精子质量的影响因素有环境、遗传、生活习性等诸多因素，可能本研究纳入研究对象选取上具有局限性，不足以检测出相关性。PARL基因C44055G不同基因型男性精子线粒体PARL水平有显着差异间接验证了这一结论。
综上所述，铝暴露降低铝作业工人精子活力和存活率，增加精子畸形率，而且这些改变与PARL蛋白水平密切相关。然而，铝致生殖毒作用损伤的机制及PARL基因C44055G多态性是否是下调精子线粒体PARL蛋白的作用机制目前仍尚未明确，需后续深入研究加以论证。
