黄小强 ，朱怀昌 ，许 文 ，吴水生 ，黄 涛 ，贾 安 *

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.黄河科技学院医学院，河南 郑州 450063）

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种常见的临床综合症，其致伤因素主要分为间接因素和直接因素（包括机械因素、化学因素、生物因素）导致的急性进行性呼吸功能不全或呼吸衰竭症状，具有较高的发病率和病死率［1-2］，研究统计 ALI 致死率高达 30%～50%［3］。 目前，临床上常用机械通气、激素和抗炎药物治疗，但存在着明显缺陷，如条件限制、难以推广、药物毒副作用明显、预后差等［4］，因此开发一种安全有效的防治ALI 药物尤为迫切。

泽泻来源于泽泻科泽泻属植物泽泻［Alisma orientale （Sam.） Juzep.］的干燥块茎，其性寒，味甘，具有利湿、清热、化浊降脂等功效［5-6］，主产于福建、江西、四川等地，其中福建产泽泻最为优质，为福建着名道地药材。 现代药理学研究表明：泽泻具有抗炎、利尿、降血糖、调节血脂等药理作用［7-10］。研究发现泽泻主要化学成分是三萜类化合物［11］，课题组前期开展了泽泻总三萜部位的富集纯化工艺研究，得到总萜含量达到50%以上的三萜部位，同时课题组通过体内和体外炎症模型证明了泽泻总三萜具有抗炎作用［7］，但对 ALI 的研究尚未见报道。 本研究主要是探究泽泻总三萜对ALI 的保护作用，为泽泻总三萜防治ALI 的药物研发提供实验依据。

1 材 料

1.1 仪器 多功能酶标仪（奥地利Infinite 公司）；高速台式冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）；FY135 型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；DHP-9052 电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；BS-3000A 系列电子天平（上海友声衡器有限公司）；光学显微镜（日本OLYMPUS 公司）；RM2125 型石蜡切片机（德国Leica 公司）。

1.2 药品与试剂 泽泻饮片购自福建金山医药集团，经福建中医药大学药学院范世明高级实验师鉴定，为泽泻科植物泽泻 Alisma orientale（Sam.）Juzep.，样品寄存在福建中医药大学药学院标本室。 脂多糖（LPS，美国 Sigma 公司，货号：L2630，规格：10 mg／支）；地塞米松片（广东南国药业有限公司，规格：0.75 mg／片）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）ELISA 检测试剂盒（上海西塘生物科技有限公司）；髓过氧化物酶（MPO）活性检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 动物 60 只SPF 级 KM 小鼠，雌雄各半，体质量18～20 g，购自上海史莱克实验动物中心，生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006，饲养于福建中医药大学动物实验中心SPF 级动物房，使用合格证号：SYXK（闽）2014-0005。饲养环境：温度 21～23℃，相对湿度55%～75%，明暗各12 h，适应性饲养7 d后用于实验。

2 方 法

2.1 药物制备

2.1.1 泽泻总三萜的制备 参考课题组前期研究泽泻总三萜的制备方法［11］制备成浓度为2.5、5.0、10.0 mg／mL，即低、中、高 3 种浓度泽泻总三萜，备用。

2.1.2 地塞米松溶液的制备 将地塞米松片研成细粉末，溶于水中，制备成质量浓度0.000 5 g／mL 的溶液，备用。

2.2 分组与给药 将60 只小鼠适应性饲养1 周后，随机分为正常组，模型组，地塞米松组，泽泻总三萜低、中、高剂量组（简称低、中、高剂量组），每组10 只。低、中、高剂量组分别以 25、50、100 mg／kg 泽泻总三萜灌胃，地塞米松组以5 mg／kg 地塞米松进行灌胃，正常组和模型组予等量常温生理盐水灌胃，每天1 次，连续给药14 d。 末次给药后2 h，剔除小鼠颈部正中毛发，酒精消毒，正中切开颈部皮肤，深度约2 cm，暴露并分离气管，采用样品进样器于气管内慢慢滴注 LPS 生理盐水溶液（0.5 mL／kg），正常组采用同样方法给予相应体积的生理盐水，滴注结束后消毒并缝合皮肤［12］。 禁食不禁水，造模12 h后，小鼠眼眶采血，随后处死小鼠，迅速取出小鼠的肺组织，备用。

2.3 小鼠肺组织湿／干重比值（W／D）测定 参考文献［13］，取右肺上叶，除去结缔组织，用滤纸吸干表面水分和血液，称量得到肺组织湿重；随后将肺组织放置在80 ℃恒温干燥箱中连续干燥48 h 以上，称量肺组织干重并记录，计算（W／D）：

W／D＝肺组织湿重／肺组织干重×100%

2.4 小鼠肺组织中MPO 活性测定 取适量小鼠肺组织于组织匀浆器中，加生理盐水并在冰水浴中进行研磨，离心得上清液，按照MPO 试剂盒说明书检测肺组织中MPO 活性。

2.5 小鼠血清中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量测定

取血液样本，3 000 r／min 离心 10 min，取上清，按照试剂盒说明书步骤，采用ELISA 法测定小鼠血清中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量。

2.6 肺组织病理学检查 取右肺下叶固定于10%中性甲醛溶液中，24 h 后取出，使用蒸馏水冲洗至无味；然后对其进行常规的脱水、浸蜡、包埋、切片、苏木素-伊红染色、封片，在显微镜下对其进行病理学观察，并进行病理学评分。 评分标准参考文献［14］，包括肺泡壁厚度、 肺组织破坏和炎症细胞浸润，每个指标按5 分制评分：0 分为最小损伤，1 分为轻度损伤，2 分为中度损伤，3 分为重度损伤，4 分为最大损伤。 肺损伤评分为3 个指标评分之和。

2.7 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件进行数据处理。 计量资料符合正态分布的以（±s）表示，采用单因素方差分析检验。

3 结 果

3.1 各组小鼠肺组织W／D 比较 见表1。

表1 各组小鼠肺组织 W／D 比较（±s）

表1 各组小鼠肺组织 W／D 比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

W／D 3.76±0.60 5.94±0.501）4.05±0.493）5.78±0.37 5.26±0.592）4.10±0.623）组别正 常 组模 型 组地塞米松组低剂量组中剂量组高剂量组n 10 10 10 10 10 10

3.2 各组小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量和肺组织中MPO 活性比较 见表2。

表2 各组小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量和肺组织中 MPO 活性比较（±s）

表2 各组小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量和肺组织中 MPO 活性比较（±s）

注：与正常组比较，1） P＜0.01；与模型组比较，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

组别正 常 组模 型 组地塞米松组低剂量组中剂量组高剂量组n 10 10 10 10 10 10 TNF-α／（pg／mL）241.28±57.47 682.32±113.891）426.68±89.903）636.11±109.70 558.40±100.242）531.05±81.173）IL-6／（pg／mL）59.33±18.06 212.45±45.201）103.98±20.553）177.94±24.902）163.23±38.512）150.77±32.113）IL-1β／（pg／mL）77.43±12.16 316.45±39.051）183.97±31.643）287.94±25.63 273.23±36.792）260.77±24.333）MPO ／（U／g）2.42±0.59 5.72±0.701）4.51±0.693）5.41±0.68 5.07±0.542）4.83±0.523）

3.3 各组小鼠肺组织病理形态学和肺损伤评分比较 见图1、图2。

4 讨 论

ALI 是临床常见的一种严重疾病，其发病机制复杂，发生迅速，死亡率高［15］。革兰阴性菌感染导致肺炎时是ALI 最常见的诱导因素，LPS 是革兰氏阴性菌外膜的一种成分，同时也是主要致病物质［16］。LPS 刺激能够活化巨噬细胞，诱导机体释放大量TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等炎症因子，进而引发急性炎症［17］。虽然目前关于ALI 的致病机制尚不清楚，但是大量研究报道认为，肺组织的炎症反应失衡是导致ALI 发生的根本原因［18］。地塞米松属于糖皮质激素，具有强大的抗炎、抗过敏作用，可较好地减轻由ALI 所致的肺损伤［19］，因此本研究以地塞米松为阳性对照。 本研究结果显示泽泻总三萜能够显着性降低 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 炎症因子，提示泽泻总三萜保护LPS 诱导的急性肺损伤与抑制炎症因子分泌有关。

肺组织的 W ／D 可反映肺水肿程度［20］。 本研究结果显示泽泻总三萜能够显着降低W／D，减轻LPS所诱导的ALI。 此外，本研究结果显示模型组小鼠肺组织损伤严重，可见弥漫性肺水肿，肺泡壁和肺泡间隔明显增宽，大量炎症细胞浸润，而给予泽泻总三萜后上述病理变化明显减轻。

总之，泽泻总三萜能够降低W／D 和MPO 活性，同时也能够降低血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 炎症因子含量，提示泽泻总三萜对LPS 所致的急性肺损伤具有一定的保护作用，其作用机制与泽泻总三萜抑制细胞炎症因子分泌有关。

图1 各组大鼠肺组织病理形态学光镜图（×200）

图2 各组大鼠肺损伤评分柱状图