益肾降浊化瘀方对肾间质纤维化大鼠肾组织Smad2、CHIP 水平的影响*

远 方 赵万超

（辽宁中医药大学附属医院住院部肾内科，辽宁 沈阳 110032）

目前肾纤维化（肾小球硬化和肾间质纤维化）是肾脏在各种急慢性致病因素（包括炎症、损伤等）作用下的病理改变过程，细胞外基质（Extra cellular matrix，ECM）在肾脏过度沉积是其主要病理特征。近年来纤维化相关细胞因子的发现及相应抗纤维化方法的提出使现代医学抗肾纤维化的研究有了很大进展，但研究表明这些方法临床治疗效果并不理想，而且大多数实验仍处于动物实验阶段。从中医病机角度分析，肾脏纤维化作为一个过度修复的过程，应该属于“邪气实”，因此既往以补益肾气、活血化瘀、泄浊作为肾纤维化治疗的主要中医治疗方法。中医理论认为肾脏疾病表现为实证时，必定有其正虚的一面，即所谓“邪之所凑，其气必虚”，瘀血为邪实之首，贯穿于肾纤维化过程中，因此治疗上需扶正化瘀，邪正兼顾，使祛邪不伤正，扶正不助邪，方奏捷效。益肾降浊化瘀方是辽宁省中医院肾内科临床经验方，以“益气化瘀泄浊法”理论为基础，经多年的临床应用证明，此方可明显改善早期慢性肾衰竭患者的临床症状[1-3]。因此，本实验主要研究益肾降浊化瘀方对肾间质纤维化模型大鼠肾组织Smad2 及CHIP 的影响，探索益气化瘀泄浊法抗肾间质纤维化的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级40 只雄性SD 大鼠，体质量（180±20）g，均购自辽宁中医药大学实验动物中心。此次实验方案经由辽宁中医药大学伦理委员会批准，在辽宁中医药大学实验动物中心清洁级动物房饲养及观察。

1.1.2 实验药物 益肾降浊化瘀方由丹参10 g，牡丹皮12 g，牛膝15 g，大黄9 g，黄芪30 g，太子参20 g，砂仁6 g，山萸肉15 g，藿香15 g，佩兰15 g，清半夏10 g，茯苓15 g，白茅根15 g，菟丝子15 g，14 味中药组成。购买于辽宁中医药大学附属医院门诊部草药局，常规水煎2 次后合并滤液浓缩成1 g/mL（每毫升含1 g 生药），放置4 ℃冰箱冷藏备用。尿毒清颗粒购于沈阳市国大药房（内蒙古康臣药业有限责任公司，规格：5 g/袋，国药准字Z20073256）。

1.1.3 主要试剂和仪器 4%多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，20170513A），大鼠Smad2、CHIP 免疫组化试剂盒均（北京博奥森生物技术有限公司，GR245116-5、GR32006021-7）。总RNA 提取物试剂盒购于北京天根生物，引物由上海生物生工提供。全自动生化分析仪（日本东芝），自动平衡离心机（长沙天创仪器制造有限公司），BS-51 型显微镜（日本Olympus），电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备及分组 将40 只SPF 级健康SD 雄性大鼠随机选取10 只作为空白对照组，其余30 只根据文献[4]建立肾间质纤维化大鼠模型。按200 mg/kg 剂量给予2.0%的腺嘌呤混悬液，每日定时给药，前12 d 每日给药1 次，第13 天开始，隔日给药1 次，动物造模过程28 d。造模结束后随机分为模型组、尿毒清组、益肾降浊化瘀方组。

1.2.2 给药方案 模型制备成功后，益肾降浊化瘀方组以20.2 g/kg 灌胃给药，尿毒清组予尿毒清颗粒混悬液2.5g/kg 灌胃。模型组、空白对照组给予等体积纯净水，1 次/d，均于每日上午8：30—9：30 灌胃1 次，连续给药28 d。

1.2.3 肾组织标本制备 标本采集于29 d 上午，将SD雄性大鼠称重，用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，处死SD 大鼠，取出肾脏，取部分肾脏组织置于4%的多聚甲醛溶液中固定保存用于免疫组化检测，余下组织保存于-80 ℃冰箱用于Western blot 检测。

1.2.4 免疫组织化学检测 常规固定、脱水、石蜡包埋、切片（厚度为4 μm），置于防脱片载玻片上，捞片后入烤箱烘烤（58～60 ℃）50 min，使切片紧密黏附；PBS 缓冲液冲洗5 min 2 次；新配制的3%双氧水与蒸馏水按1∶10 混合于室温条件下10 min 以灭活内源性酶，蒸馏水洗2 min 3 次；0.01 mol/L 枸橼酸盐（pH 6.0）浸渍切片，电磁炉煮沸后断电，每10 min 重复1 次，冷却后用PBS（pH 7.2～7.6）洗涤2 次，室温下5 min 左右，PBS（pH 7.2～7.6）洗3 次；滴加5%BSA 封闭液，室温条件下20 min 后切片上多余液体蒸发干净；滴加适当稀释的兔抗鼠Ⅲ型胶原（ColⅢ）抗体、兔抗鼠Ⅳ型胶原（ColⅣ）抗体（一抗）37 ℃孵育1 h，PBS（pH 7.2～7.6）洗2～3 次；滴加生物素标记兔抗大鼠IgG（二抗），37 ℃孵育20 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min 4 次；蒸馏水1 mL 分别加入到DAB 试剂盒A、B、C 试剂中各1 滴，混合均匀后加至切片37 ℃反应30 min；蒸馏水洗，脱水，透明，树脂胶封片；奥林巴斯BS-51 显微镜观察；以细胞质或细胞核中出现棕黄色颗粒作为阳性表达标准，以不着色为阴性标准。采用JD801 数码显微图像分析系统软件分析，在200 倍光镜下每张切片随机选取5 个视野拍照，测量积分光密度值（积分光密度=平均光密度×选定对象面积），取其平均值进行分析，比较各组Smad2 及CHIP 阳性表达差异。

1.2.5 蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）检测大鼠肾组织中Smad2 及CHIP 相关蛋白表达情况，将100 mg 大鼠肾脏组织剪碎，其后使用磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗，进行离心，离心后加入裂解液，冰水浴当中进行匀浆，其后再次离心10 min 取上清液，再应用BCA 法测定蛋白浓度调平，调平后使用SDS-PAGE 凝胶电泳，完成后使其转移至PVDF 膜（0.45 μm）上，其后使用5%脱脂奶粉封闭2 h，于冰箱调至4 ℃与一抗温育过夜。隔日滴加二抗于室温孵育1 h，其后使用显色液显色，暗室曝光下应用全自动化学发光图像分析仪扫描样本光密度，并收集样本图像以行灰度分析，以β-actin 为参照。

1.3 统计学方法 数据处理采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析。计量资料以（）表示，多组间均数比较用单因素方差分析，各组两两比较用LSD 法。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测结果 肾组织Smad2 及CHIP 表达半定量分析免疫组化结果表明，经药物干预后，Smad2 及CHIP 在尿毒清组及益肾降浊化瘀方组蛋白水平表达较模型组显着降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；益肾降浊化瘀方组与尿毒清组比较无差异统计学意义（P ＞0.05）。提示益肾降浊化瘀方对SD 大鼠肾组织Smad2、CHIP 蛋白水平的表达具有抑制作用。见表1。

表1 各组大鼠Smad2、CHIP 积分光密度值比较 （，μg/L）

表1 各组大鼠Smad2、CHIP 积分光密度值比较 （，μg/L）

注：与正常组比较，※P<0.05；与模型组比较，●P<0.05；与尿毒清组比较，○P＞0.05。

2.2 Western Blot 检测结果 与正常组比较尿毒清组和益肾降浊化瘀方组Smad2、CHIP 蛋白表达显着上升，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与模型组比较，各给药组Smad2、CHIP 蛋白表达均有不同程度显着降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；尿毒清组和益肾降浊化瘀方组差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1，表2。

图1 各组大鼠肾组织Smad2、CHIP 蛋白表达条带图

表2 各组大鼠肾组织Smad2、CHIP 蛋白表达（）

表2 各组大鼠肾组织Smad2、CHIP 蛋白表达（）

注：与正常组比较，※P<0.05；与模型组比较，●P<0.05；与尿毒清组比较，○P＞0.05。

3 讨论

各种慢性肾脏病是进展到终末期肾病的共同转归，从世界卫生组织统计数据中可见2012 年全球慢性肾脏病所致死亡人数已达全球总体死亡人数的1.5%[5]；我国有关慢性肾脏病的统计中，其患病率大约占致13%，与2012 年数据相比，已上升了近3%[6]。全球及我国的统计数据表明，慢性肾脏病与日俱增的发病率并且严重危害患者生命健康。其主要病理学特征为肾间质纤维化。肾间质纤维化发生机制是由炎症细胞、细胞因子和炎症介质等多种作用因素导致肾脏组织中间质细胞增多，进而形成纤维组织，导致肾脏结构受到损伤。现代医学对于慢性肾脏病的治疗用药较多，但仍以控制饮食、对症控制血压、血糖、纠正离子及代谢紊乱等为主，因个体原发病差异较大，治疗效果并不明显。中医学对于慢性肾脏病的治疗，特别在延缓肾功能进展方面均取得了较好的效果。辽宁中医药大学附属医院肾内科临床应用多年的益肾降浊化瘀方以“补肾益气、降浊化瘀”的思路为辨证指导，通过中药各药物间的配伍从而达到多靶点、多途径的治疗目标，对于延缓慢性肾脏病、改善肾间质纤维化均取得了较好的临床效果[7-9]。

该方由菟丝子、牛膝、太子参、山萸肉、茯苓、黄芪、丹参、砂仁、牡丹皮、大黄、藿香、佩兰、清半夏、白茅根14 味中药组成，为肾内科名老中医治疗气虚湿浊瘀阻所致慢性肾衰之精炼组方。具有补肾益气、活血化瘀、化湿泄浊的功效。方中重用黄芪、太子参及菟丝子为君药补肾益气，辅以丹参、牛膝、大黄、砂仁、藿香等臣药共奏活血化瘀通络、化湿泄浊之功。

既往有学者研究表明，TGF-β 1 作为一种强效的致纤维化因子，为肾纤维化发生、发展过程中重要的作用因子，而Smad2 是完成TGF-β 1 致纤维化信号传导作用的重要下游递质，主要作用于促进细胞外基质肾脏纤维化的形成[6]。CHIP 作为泛素E3 连接酶介导Smad 蛋白的降解，对于Smad 家族起着必不可少的调配作用。因此，干预CHIP 的异常表达成为研究肾间质纤维化的重要靶点之一。

结果说明，益肾降浊化瘀方能有效延缓CRF 肾间质纤维化的发展，其机制可能与抑制CHIP 及Smad2 等因子的表达有关。而益肾降浊化瘀法中药复方治疗慢性肾脏病具有多靶点、多调控机制的作用，但其内在作用机制及调控靶点仍需要进一步研究。